均相自發泡法制備抗菌多孔復合骨修復支架*

李　根，李麗梅，蔣佳興，李炯炯，左　奕，李玉寶，鄒　琴，張　利，李吉東

(四川大學 分析測試中心，成都 610064)

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均相自發泡法制備抗菌多孔復合骨修復支架*

李根，李麗梅，蔣佳興，李炯炯，左奕，李玉寶，鄒琴，張利，李吉東

(四川大學 分析測試中心，成都 610064)

摘要：與植入骨修復材料相關的感染仍是臨床面臨的難題，能控釋或緩釋抗菌劑的骨修復材料在易感染骨缺損修復領域越來越受到青睞。在具有良好生物相容性和成骨作用的納米羥基磷灰石/聚氨酯(nHA/PU)復合材料中添加磷酸銀作為抗菌劑，復合磷酸氫鈣結晶水合物(DCPD)作為發泡劑水的來源，通過釋放DCPD中結晶水與PU中異氰酸根反應產生CO2氣體實現了復合材料均相發泡成型。實驗結果顯示，85 ℃條件下自發泡制備的載磷酸銀羥基磷灰石/磷酸氫鈣/聚氨酯(Ag3PO4-nHA/DCPD/PU)復合支架的孔隙率高達80%，抗壓強度可達2.83MPa；制備的抗菌支架能有效抑制細菌在材料表面黏附，與細菌接觸24h后抑菌率可達95.45%。該方法簡便易行，制備的孔隙分布均勻、貫通性好、孔隙率高和力學性能佳的抗菌復合支架在骨修復領域有較大的應用潛力。

關鍵詞：抗菌；聚氨酯；納米羥基磷灰石；磷酸銀；自發泡

0引言

臨床發現骨修復材料植入機體后，細菌易在植入材料表面定植，常會導致與植入材料相關的細菌感染，影響材料周圍細胞和組織與材料間的良性交互作用，甚至造成骨質流失，導致骨修復失敗。一旦感染發生，患者即使口服或注射大劑量抗生素也難以起到有效治療作用，而且抗生素的濫用正在不斷增長細菌耐藥性。因此，研制自身具有抗菌、抗感染性能的骨修復材料已成為生物材料領域研究熱點之一[1-3]。

研究人員嘗試在骨修復材料中加入抗菌成分，如銀及其化合物、二氧化鈦、殼聚糖、季銨鹽、抗生素等[4-9]，賦予材料抗菌性能。二氧化鈦(TiO2)是光催化型抗菌劑，在植入材料領域難以發會作用；季銨鹽存在化學穩定性差、易產生抗藥性、有溶血作用、對革蘭氏陰性菌(如：大腸桿菌)抑制作用弱等缺點；殼聚糖耐熱性差、加工困難、藥效持久性差。載抗生素類骨修復材料植入體內雖在局部能發揮較好的抗菌作用，但隨著抗生素逐漸釋放，后期殘留在材料中的抗生素無法達到有效殺菌濃度，進而易誘導細菌產生耐藥性；同時載抗生素類材料存在藥物突釋，以及不同生理環境下藥效變低等缺點。銀系抗菌劑具有抗菌譜廣、不易產生耐藥性等優勢，已在抗菌骨修復材料領域引起廣泛關注[4,10-11]。硝酸銀中銀離子釋放過快，作為抗菌劑難以滿足持續、長效抗菌需求；磷酸銀微溶于水，在有水存在的環境中可緩慢釋放出高抗菌活性的銀離子，起到抗菌作用。課題組前期在可注射聚氨酯中添加磷酸銀制備了抗菌根管充填材料，研究表明，當復合材料中的磷酸銀添加量為3%(質量分數)時，制備的根管充填材料兼具強抗菌性能和良好的生物相容性[12]。

聚氨酯由軟硬段構成的嵌段聚合物，可根據需求選擇不同軟硬段或調整軟硬段比例即可獲得不同理化性能和降解性能，因其良好的生物相容性、力學性能和性能可調控等優點已在骨組織工程領域廣泛研究[13-15]。納米羥基磷灰石/聚氨酯(nHA/PU)多孔骨修復支架材料已顯示出優良的生物相容性和成骨作用[16-17]。因合成聚氨酯原料中存在的異氰酸根可與水反應生成CO2，制備聚氨酯類多孔支架常用水作為發泡劑[17-18]。盡管水安全無毒，但隨著反應進行，復合材料體系粘度逐漸增大，后期加入的發泡劑水很難均勻分散其中，從而影響支架孔隙結構均勻性和孔隙連通性。在復合材料合成過程中將發泡劑水以磷酸鈣鹽結晶水的形式均勻復合在聚氨酯復合材料中，在高于結晶水釋放溫度條件下，釋放結晶水與PU中的異氰酸根反應生成CO2，可實現復合材料均相發泡，制得孔隙均勻、貫通性好、力學性能佳的磷酸鈣鹽/聚氨酯復合多孔骨修復支架。

基于臨床需求和前期的研究基礎，本研究在nHA/PU材料中復合磷酸銀作為抗菌劑，復合磷酸氫鈣結晶水合物(DCPD)作為發泡劑，在一定條件下使DCPD釋放結晶水，實現聚氨酯基復合材料均相發泡，制備孔隙率高、孔隙均勻、貫通性好的抗菌復合骨修復支架，并對支架的理化性能和抗菌性能進行表征。

1實驗部分

1．1試劑與原料

蓖麻油(CO)、1，4-丁二醇(BDO)、辛酸亞錫購自成都市科龍化工試劑廠，異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)、甘油(GL)購自上海晶純生化科技股份有限公司，DCPD購自天津市光復精細化工研究所，均為分析純，Ag3PO4購自百靈威科技有限公司，nHA按文獻方法由本實驗室自制[18]。

1．2多孔支架的制備

首先參考文獻方法[18]制備nHA/DCPD/PU復合材料，然后在大于75 ℃溫度條件下使DCPD釋放結晶水與聚氨酯預聚體中的異氰酸根反應生成CO2，實現復合材料均相自發泡成型，其中無機填料約占30%(質量分數)。即在氮氣保護下，取15g甘油改性的蓖麻油(GCO)加入三頸瓶中，70 ℃油浴加熱并保持一定強度的機械攪拌0.5h，加入6.5gDCPD固體粉末(過300目篩)、6.5gnHA粉末，使其與改性的蓖麻油充分混合。逐漸滴加15gIPDI(蓖麻油與IPDI的摩爾比為1∶1.5)，反應得到nHA/DCPD/PU復合材料預聚物。然后加入0.05mL催化劑辛酸亞錫，反應約0.5h，再加入0.5mLBDO作為擴鏈劑，繼續反應約2h，在90 ℃熟化發泡24h，洗滌、烘干得到nHA/DCPD/PU復合多孔支架。Ag3PO4-nHA/DCPD/PU的制備方法同上，無機填料占30%(質量分數)，包括5.85gnHA、5.85gDCPD和1.3gAg3PO4粉末；發泡溫度為85 ℃。所制備的復合支架的編號及成分如表1所示。

表1復合支架的編號及成分

Table1Theabbreviationandcompositionoffabricatedcompositescaffolds

樣品Ag3PO4含量/wt%nHA含量/wt%DCPD含量/wt%PU含量/wt%nHA/DCPD/PU0151570Ag3PO4-nHA/DCPD/PU313.513.570

1．3表征方法

采用掃描電子顯微鏡(SEM，JSM-6500LV，Jeol，Japan)觀察多孔支架的形貌結構；使用能譜儀(EDS)分析Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架表面鈣、磷和銀元素分布，掃描時間為60s；利用X射線衍射儀(XRD，DX-2000，中國丹東方圓公司)分析復合材料中無機物晶相；利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，Nicolet6700，USA)分析材料中官能團的位置和強度變化；采用AG-IC50型(SHIMADZU，Japan)力學試驗機，依據國標GB/T1 041-92測試支架的抗壓強度和彈性模量，試驗的壓頭速度為0.5mm/min。

1．4孔隙率測定

采用水浸漬法測定孔隙率：干燥待測樣品，測量體積為V，稱重(W1)；然后浸入去離子水(密度ρ)中直至充盈浸透，取濕樣稱重(W2)，由下述公式(1)計算孔隙率P。

(1)

1．5抗細菌粘附實驗

選用金黃色葡萄球菌(S.aureus,ATCC25923)評價支架的抗菌性能。將nHA/DCPD/PU、Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架(?6mm×2mm)用環氧乙烷滅菌，浸入2mL濃度約106CFU/mL的菌懸液中，于(37±1) ℃ 培養箱中培養24h。取出樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，經固定、梯度脫水、臨界點干燥、噴金等處理后用SEM觀察細菌在不同材料表面的粘附情況。

1．6抑菌率實驗

分別依次向6支試管中加入200μL濃度為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液，然后將Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架(?6mm×2mm)分別放入其中3支試, 剩余3支試管為空白對照。加入材料后開始計時，分別作用1，3，7，12和24h后，用移液槍從每支試管中移取200μL至2mL的生理鹽水中，充分混勻，作適當稀釋，取3～4個稀釋度，分別移取200μL置于兩個培養皿，傾注15mL40～45 ℃的營養瓊脂培養基，轉動培養皿，使金黃色葡萄球菌均勻地分布到營養瓊脂平板上。瓊脂凝固后翻轉平板，在(37±1) ℃孵箱內培養48h，作活菌菌落計數。所有實驗重復3次，按式(2)計算抑菌率(Bacteriostaticrate)

(2)

式中，Ncontrol為對照液平均菌落數，CFU/mL；Nsample為被試樣液平均菌落數，CFU/mL。

2結果與討論

2.1多孔支架形貌

DCPD在溫度大于75 ℃逐漸釋放出結晶水，可與PU中的—NCO反應生成CO2，實現材料自發泡成型。實驗發現，添加磷酸銀的復合材料在85 ℃發泡制備的Ag3PO4-nHA/DCPD/PU復合支架與90 ℃發泡制備的nHA/DCPD/PU支架結構相似，因此本文用90 ℃制備的nHA/DCPD/PU支架作為對照組。SEM觀察表明，兩種復合支架均富含貫穿孔，孔徑分布較均勻，主要集中在300～700μm(圖1(a,b))，此孔結構有利于提高細胞粘附，增加血管和組織的長入，以及有益于營養物的循環[19]。

由圖1(c)-(e)可知，Ca、P和Ag元素在Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架中分布均勻，表明nHA、DCPD和Ag3PO4都均勻地分布在PU基體中。EDS面掃描圖中各種元素的分布密度反映了材料中各種元素的含量，Ca和P元素含量較Ag元素高，與初始原料中的元素含量相對應。

圖1復合多孔支架的SEM照片

Fig1SEMmicrographsofcompositeporousscaffolds

2.2X射線衍射分析

從圖2可以看出，nHA/DCPD/PU和Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架的XRD譜圖中均出現了nHA、DCPD和無水磷酸氫鈣(DCPA)的衍射峰，峰強度較弱，可能是無機粒子被PU包覆，使其衍射峰強度減弱。DCPD和DCPA衍射峰同時出現表明在發泡過程中部分DCPD脫去結晶水，生成了DCPA，以DCPA形式存在于復合材料中。從Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架的XRD譜圖可觀察到明顯的Ag3PO4的衍射峰。盡管Ag3PO4在材料中含量較低，但因磷酸銀結晶度高，仍顯示出較強的衍射峰強度。

圖2nHA/DCPD/PU和Ag3PO4-nHA/DCPD/PU復合支架的XRD譜圖

Fig2XRDpatternsofnHA/DCPD/PUandAg3PO4-nHA/DCPD/PUcompositescaffolds

2.3FT-IR分析

圖3為支架的紅外光譜圖，3 338，1 712，1 520和1 230cm-1附近出現的吸收峰表明反應生成了氨基甲酸酯交聯鍵[18, 20-21]。

圖3nHA/DCPD/PU和Ag3PO4-nHA/DCPD/PU復合支架的紅外光譜圖

Fig3FT-IRspectraofnHA/DCPD/PUandAg3PO4-nHA/DCPD/PUcompositescaffolds

2.4支架孔隙率與力學性能

表2列出了nHA/DCPD/PU和Ag3PO4-nHA/DCPD/PU復合多孔支架的孔隙率、抗壓強度和彈性模量。結果顯示，Ag3PO4的加入對復合支架的孔隙率沒有明顯影響，復合支架的孔隙率在80.5%左右；但對復合支架的力學性能產生了顯著的影響，抗壓強度和模量分別增加到2.83和116MPa，相比nHA-DCPD/PU支架增加了87%和170%。制備的抗菌復合支架的孔隙率和力學強度都能較好的滿足骨組織工程支架的要求[22]。

表2nHA/DCPD/PU和Ag3PO4-nHA/DCPD/PU多孔復合支架的孔隙率和力學性能

Table2PorosityandmechanicalpropertiesofnHA/DCPD/PUandAg3PO4-nHA/DCPD/PUcompositescaffolds

組成孔隙率/%強度/MPa模量/MPanHA/DCPD/PU80.3±1.221.51±0.1543.49±4.24Ag3PO4-nHA/DCPD/PU80.7±3.772.83±0.4116±24.93

2.5抗細菌粘附實驗

由圖4可以看出，與金黃色葡萄球菌菌懸液共培養24h后，nHA/DCPD/PU支架表面附著大量細菌(圖4(a))，Ag3PO4-nHA/DCPD/PU表面僅有少量細菌粘附，說明Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架具有較強的抗細菌粘附能力(圖4(b))。說明分布在材料表面的磷酸銀可有效抑制金黃色葡萄球菌在材料表面粘附和增殖，發揮接觸抗菌作用。

圖4金黃色葡萄球菌在復合多孔支架表面粘附的SEM照片

Fig4SEMmicrographsofS.aureusadhesiononcompositeporousscaffolds

2.6抑菌率實驗

因Ag3PO4-nHA/DCPD/PU能有效抑制細菌在材料表面黏附，本研究進一步測試了該抗菌支架對金黃色葡萄球菌的抑菌率，結果如圖5所示。Ag3PO4-nHA/DCPD/PU與菌懸液接觸培養1，3，7，12和24h后，抑菌率分別為52.38%，68.25%，85.56%，90.37%與95.45%。抑菌率隨著抗菌時間的延長而呈現出增大趨勢，12h后抑菌率即超過90%，說明Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架對金黃色葡萄球菌具有高效的抑制和殺滅作用。其機理可能是隨著抗菌時間的延長，更多銀離子從支架中釋放出來，發揮抗菌作用。

圖5Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架對金黃色葡萄球菌的抑菌率

Fig5BacteriostaticrateofAg3PO4-nHA/DCPD/PUscaffoldsagainstS.Aureus

3結論

(1)在nHA/PU材料中復合磷酸銀作為抗菌劑，復合DCPD作為發泡劑水的來源，通過釋放結晶水與PU中異氰酸根反應產生CO2氣體實現了復合材料均相發泡，制備了孔隙分布均勻、貫通性好、孔隙率高和力學性能佳的抗菌復合骨修復支架。

(2)Ag3PO4-nHA/DCPD/PU支架能有效抑制細菌在材料表面黏附，與細菌接觸24h后抑菌率可達95%，表明添加3%(質量分數) 的Ag3PO4可賦予磷酸鈣/聚氨酯復合支架良好的抗菌活性。

(3)制備的兼具適宜孔結構和高抗菌性能的復合多孔支架在骨修復領域有較大的應用潛力。

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Preparationofantibacterialcompositeporousscaffoldsbyhomogeneousself-foamingmethod

LIGen,LILimei,JIANGJiaxing,LIJiongjiong,ZUOYi,LIYubao,ZOUQin,ZHANGLi,LIJidong

(Analytical&TestingCenter,SichuanUniversity,Chengdu610064,China)

Abstract:Infectionassociatedwithimplantedbonerepairmaterialsisstillachallengingissueinclinic.Thebonerepairmaterialswithlocaldrug-deliverycapacityhavedrewmuchattentioninsusceptiblebonedefectrepairrecently.Inthepresentstudy,Ag3PO4wasselectedasanantibacterialagentandincorporatedintothenano-hydroxyapatite/polyurethane(nHA/PU)composite,whichhavebeenprovedtobeabiocompatiblematerialswithgoodosteogenesis.Calciumhydrogenphosphatedihydrate(DCPD)wasaddintothenHA/PUcompositeandservedasfoamingagent.Undercertaincondition,thecrystallinewatercanreleasefromDCPDandreactwithisocyanate(—NCO)togenerateCO2,resultinginthehomogeneousself-foamingofthecomposite.TheresultsrevealedthattheporosityandcompressivestrengthoffabricatedAg3PO4loadednano-hydroxyapatite/Calciumhydrogenphosphatedihydrate/polyurethane(Ag3PO4-nHA/DCPD/PU)compositescaffoldscanreach80.7%and95.45%,respectively.ThefabricatedAg3PO4-nHA/DCPD/PUscaffoldsalsocanpreventbacteriaadhesiononthematerialsurfaceeffectivelyandbacteriostaticratecanreach95.45%afterincubationthebacteriawiththematerialsfor24h.TheresultantAg3PO4-nHA/DCPD/PUcompositescaffoldswithhighporosity,uniformporousstructureandinterconnectivityaswellasstrongantibacterialpropertiesfabricatedbysuchafacilemethodhaveagreatpotentialtobeappliedinthefieldsofbonerepair.

Keywords:antibacterial;polyurethane;nano-hydroxyapatite;silverphosphate；homogeneousself-foaming

文章編號：1001-9731(2016)06-06176-05

* 基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃)重點資助項目(2013AA032203); 國家自然科學基金資助項目(31370971); 四川大學優秀青年學者基金資助項目(2014SCU04A20).

作者簡介：李根(1991-)，男，河南南陽人，碩士，師承李吉東副教授，從事生物材料研究。

中圖分類號：TB33

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.032

收到初稿日期：2016-03-28 收到修改稿日期：2016-05-10 通訊作者：李吉東，E-mail:nic1979@scu.edu.cn