血糖波動對糖尿病大鼠氧化應激及神經病變的影響

馬香香　李亞坤　陳慧曉　趙志剛

(鄭州大學人民醫院 內分泌科　河南 鄭州　450003)

?

血糖波動對糖尿病大鼠氧化應激及神經病變的影響

馬香香李亞坤陳慧曉趙志剛

(鄭州大學人民醫院 內分泌科河南 鄭州450003)

【摘要】目的研究血糖波動對糖尿病大鼠神經病變的影響及氧化應激的作用。方法將SD大鼠隨機分為3組：正常對照組(NC組)、穩定高血糖組(DS組)、波動高血糖組(DF組)。采用鏈脲佐菌素腹腔注射誘發糖尿病，DF組每天定時腹腔注射胰島素及葡萄糖，建立血糖波動模型，同時DS組給予等體積的生理鹽水建立穩定高血糖模型。12周后測定坐骨神經運動傳導速度(MNCV)，檢測血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)。 結果與NC組比較，DS組和DF組大鼠坐骨神經MNCV減慢(P<0.05)，血清MDA增高、GSH水平下降(P<0.05)；與DS組相比，DF組MNCV進一步減慢(P<0.05)，MDA增高、 GSH水平下降(P<0.05)。結論波動高血糖可使糖尿病大鼠神經病變加重，其機制可能與氧化應激水平增高有關。

【關鍵詞】血糖波動；神經病變；氧化應激

糖尿病神經病變作為糖尿病并發癥之一，是主要的致殘原因，嚴重影響患者的生存質量，發病機制尚未明確[1]。以往研究多針對慢性持續性高血糖的作用，而關于波動性高血糖對神經損傷的報道仍屬少見，且主要是細胞實驗及臨床觀察[2-3]。細胞實驗發現血糖波動較持續性高血糖雪旺細胞氧化應激水平表達增高，細胞凋亡指數更高[2]。為此，本實驗通過建立糖尿病血糖波動模型，通過檢測氧化應激相關指標，探討血糖波動對糖尿病神經病變的影響及可能機制，為臨床選取平穩降糖模式，避免血糖波動提供基礎證據。

1材料和方法

1.1實驗動物分組選擇無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠60只，200 g左右，購自河南省實驗動物中心，隨機分為正常對照組(NC組，n=16)和模型組(MC組，n=44)，模型組腹腔注射STZ 60 mg/kg，建立糖尿病模型，72 h后測隨機血糖，>16.7 mmol/L表示糖尿病造模成功。將糖尿病模型組隨機分為持續高血糖組(DS組，n=20)和血糖波動組(DF組，n=20)。DF組于每天(8:30 am，14:30 pm)腹腔注射葡萄糖液2.5 g/kg。于每天(9:00 am，15:00 pm)腹腔注射胰島素3 U制備糖尿病血糖波動大鼠模型，NC組和DS組均同時腹腔注射等量生理鹽水。于12周后頸內靜脈取血分離血清，用于血清學指標的測定。

1.2實驗試劑及儀器STZ(美國Sigma公司)；谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、大鼠糖化血紅蛋白測定試劑盒(南京建成生物研究所)；血糖儀、血糖試紙(拜安康)；NTS-2000肌電圖與誘發電位儀(上海諾誠醫療器械有限公司)。

1.3血糖及糖化血紅蛋白測定血糖波動組造模成功后，每周檢測1 d 7個時間點血糖，分別是(08:30、09:00、11:00、14:30、15:00、17:00、22:00)。12周末頸內靜脈采血測糖化血紅蛋白。

1.4氧化應激標志物的檢測血糖波動組造模12周后，頸內靜脈取血分離血清，MDA、GSH含量嚴格按照試劑盒測定。

1.5坐骨神經傳導速度測定血糖波動組造模12周后，測大鼠坐骨神經運動傳導速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。方法：麻醉大鼠，固定四肢，分離坐骨神經，采用肌電圖與誘發電位儀測量坐骨神經MNCV。

2結果

2.1一般情況大鼠適應性喂養1周后禁食12 h，注射STZ(60 mg/kg)后，72 h內4只大鼠死亡，余存活的40只大鼠隨機分為DS組20只，DF組20只。12周后NC組大鼠精神好、毛發光潔、攝食攝水量正常；DF和DS組大鼠均出現多飲多食多尿，毛亂無光澤，萎靡消瘦；DF組較DS組大鼠活動更少，更加消瘦；12周后DF組余16只；持續余17只，12周后3組大鼠體質量差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　血糖波動12周大鼠體質量及HbA1C水平比較±s)

注：與NC組比較，aP<0.05；與DS組比較，bP<0.05，cP>0.05。

2.2血糖波動每周1 d 7次進行血糖監測，NC組血糖波動在4.5～6.5 mmol/L，DS組19.5～25.6 mmol/L，DF組6.4～30.5 mmol/L。12周末測3組大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)，與NC組相比，DS組和DF組的HbA1c顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組HbA1C稍降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.312周末坐骨神經MNCV與NC組相比，DS組和DF組的MNCV明顯減慢，差異有統計學意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組MNCV明顯減慢，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4第12周氧化應激指標與NC組相比，DS和DF組MDA水平明顯升高，GSH水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與DS組相比，DF組MDA表達水平升高，GSH水平表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　血糖波動12周坐骨神經MNCV，血MDA、

注：與NC組比較，dP<0.05；與DS組比較，eP<0.05。

3討論

目前研究認為糖尿病神經病變的機制主要是高糖毒性、氧化應激、神經營養、微血管病變及自身免疫等多因素相互作用，導致神經細胞損傷，神經纖維缺血性脫髓鞘，引起神經病變，其中氧化應激是神經病變的核心機制。神經組織對氧化應激高度敏感，其核心是高糖環境下線粒體呼吸鏈中活性氧生成過多，引起氧化應激，造成神經炎癥、細胞凋亡導致神經損傷[1]。近年研究表明，在HbA1C相同的情況下，血糖波動較大者發生慢性并發癥的風險增加[4]。研究發現，慢性間斷高血糖與持續高血糖相比，更能引起心肌細胞、胰島細胞的凋亡，其氧化應激水平更高[5-6]；波動高血糖較持續高血糖更能提高氧化應激水平，促進腎臟系膜細胞的凋亡[7]；此外血糖波動是死亡率一個重要的獨立預測指標[8]。為此本實驗錯時腹腔注射胰島素及葡萄糖，造成1 d內血糖最大波動幅度，建立血糖波動模型，探索血糖波動對糖尿病神經病變的影響及可能機制。

丙二醛(MDA)反映脂質過氧化的程度，可間接反映細胞損傷的程度；谷胱甘肽(GSH)是一種低分子自由基、過氧化氫和脂質過氧化物清除劑，起到保護細胞膜結構和功能完整的作用，故MDA、GSH是重要的氧化應激標志物，提示機體氧化應激水平。本實驗中，與正常組相比，DS及DF組MDA水平顯著增高(P<0.05)，GSH水平明顯下降(P<0.05)，提示穩定性高血糖和波動性高血糖糖尿病大鼠較正常大鼠氧化應激水平明顯增高；與DS組相比，DF組MDA水平升高、GSH水平下降更明顯(P<0.05)，提示血糖波動較穩定高血糖可加劇糖尿病機體的氧化應激反應。

神經傳導速度代表有髓神經纖維的功能，已經成為診斷周圍神經病變的“金標準”。與正常組相比，DS組及DF組大鼠坐骨神經MNCV明顯減慢(P<0.05)，提示穩定高血糖組和波動高血糖組大鼠較正常對照組其神經功能嚴重受損。與DS組相比，DF組坐骨神經MNCV進一步減慢(P<0.05)，提示血糖波動可加劇神經功能受損，加重神經病變。

綜上所述，高血糖情況下氧化應激是神經病變的核心機制，本實驗結果波動高血糖組較穩定高血糖組有更高的氧化應激水平，坐骨神經傳導速度也進一步減慢，提示血糖波動可加重神經病變，其機制可能與血糖波動增加氧化應激水平有關，因此避免血糖波動已成為糖尿病患者治療面臨的又一新挑戰。

參考文獻

[1]Sandireddy R,Yerra V G,Areti A,et al.Neuroinflammation and oxidative stress in diabetic neuropathy:futuristic strategies based on these targets[J].Int J Endocrinol,2014,2014:674987.

[2]Sun L Q,Xue B,Li X J,et al.Inhibitory effects of salvianolic acid B on apoptosis of schwann cells and its mechanism induced by intermittent high glucose[J].Life Sci,2012,90(3-4):99-108.

[3]王國鳳,尹冬,徐寧,等.血糖波動與糖尿病周圍神經病變的相關性[J].中國糖尿病,2014,22(2):115-117.

[4]Hirseh I B.Glycemic:it’s not just about A1C any more![J].Diabetes Technol Ther,2005,(7):780-783

[5]Zhang W,Zhao S,Li Y,et al.Acute blood glucose fluctuation induces myocardial apoptosis through oxidative stress and nuclear factor-κB activation[J].Cardiology,2013,124(1):11-17.

[6]Shi X L,Ren Y Z, Wu J. Intermittent high glucose enhances apoptosis in INS-1 cells[J].Exp Diabetes Res,2011,2011:754673.

[7]許益笑,王德選,李素娟,等.血糖波動對糖尿病大鼠腎臟氧化應激與凋亡的影響[J].中華內分泌與代謝雜志,2012,28(4):325-329.

[8]Krinsley J S.Glycemic variability:a strong independent predictor of mortality in critically ill patients[J].Crit Care Med,2008,36(11):3008-3013.

Effects of oscillating blood glucose level on oxidative stress and diabetic neuropathy in diabetic rats

Ma Xiangxiang，Li Yakun，Chen Huixiao，Zhao Zhigang

(DepartmentofEndocrinologyandMetabolism，thePeople’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003，China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of oscillating blood glucose on oxidative stress and diabetic neuropathy in diabetic rats. MethodsSD rats were randomly divided into 3 groups: normal control group (NC group), diabetes sustained hyperglycemia group (DS group), diabetes fluctutating hyperglycemia group (DF group). Streptozotoein-induced diabetic model was established with SD rats and the oscillating high blood glucose animal model was induced by intraperitoneal injection of insulin and glucose at different time points every day. At the same time, DS group was given the same volume of physiological saline to establish the stable high blood glucose animal model. 12 weeks later,sciatic motor nerve conduction velocity (MNCV), blood malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were determined. ResultsCompared with NC group, the DS and DF groups had a significant increase of MDA and a decrease of MNCV, GSH(P<0.05). There was a significant increase of MDA and a decrease of MNCV, GSH in the rats with oscillating blood glucose than those with stable high blood glucose(P<0.05). ConclusionOscillating high blood glucose could induce more severe neuropathy and the mechanism may be related to the increased oxidative stress．

【Key words】diabetic neuropathy；oscillating high blood glucose；oxidative stress

通訊作者：趙志剛，E-mail：mxx123xx@126.com。

【中圖分類號】R 363

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.06.002

(收稿日期：2015-10-21)