黑色素細胞中過量表達Pax610Neu基因對MITF和TYR的影響

聶瑞強，楊玉靜，謝建山,2，范瑞文，高文俊，董常生

（1山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801；2山西醫科大學基礎醫學院，太原030001）

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黑色素細胞中過量表達Pax610Neu基因對MITF和TYR的影響

聶瑞強1，楊玉靜1，謝建山1,2，范瑞文1，高文俊1，董常生1

（1山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801；2山西醫科大學基礎醫學院，太原030001）

摘要：【目的】 MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的調節基因，而Pax6通過調控MITF和β-catenin來調控黑色素細胞的黑色素生成，通過對只含有正常Pax6 paird domain 的前102個氨基酸的Pax610Neu的研究，來探究Pax610Neu是否還有生物學功能，以及Pax6對其下游基因的作用機理。【方法】根據NCBI查找到的Pax610Neu基因序列設計PCR引物，克隆Pax610Neu，收集所得基因片段送華大基因測序確認。后通過對Pax610Neu和慢病毒表達載體的序列分析來篩選合適的酶切位點，通過分析選取Sal I和Xba I作為酶切位點，設計含有Sal I和Xba I酶切位點的PCR引物，大量克隆Pax610Neu基因，從而通過膠回收得到含有Sal I和Xba I酶切位點的Pax610Neu基因。將含有酶切位點的目的片段與T載體相連，并送華大基因測序。將與T載體連接成功的質粒導入感受態細胞使其大量擴增，提取質粒，雙酶切后，膠回收，得到大量含有Sal I和Xba I酶切位點的Pax610Neu基因片段，將其與含有小鼠tyrp2特異性啟動子和綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒表達載體相連接，送華大基因測序確認。將連接好的慢病毒表達載體導入感受態細胞使其大量擴增，通過質粒中提試劑盒獲得大量去內毒素的Pax610Neu慢病毒真核表達載體。將慢病毒真核表達載體通過細胞轉染導入到培養的綿羊黑色素細胞中，使其過量表達。收集細胞，分別通過觀察綠色熒光蛋白和使用RT-PCR來檢測轉染效率，使用RT-PCR和Western blot來檢測MITF和TYR在mRNA和蛋白水平的變化，同時檢測黑色素細胞中黑色素生成量的變化。【結果】與正常組相比，在mRNA水平，MITF顯著升高3.2倍（P＜0.05），TYR升高1.31倍，由此得出，Pax610Neu可以有效促進MITF mRNA 的產生，對TYR mRNA產生的影響不是太顯著；在蛋白質水平，MITF顯著升高8.24倍（P＜0.001），TYR顯著升高2.09倍（P＜0.001），由此得出，Pax610Neu可以顯著提高MITF 、TYR 蛋白的產生；同時黑色素細胞產生黑色素的量顯著升高1.22倍（P＜0.05），由此得出Pax610Neu可以有效促進黑色素細胞黑色素的生成。【結論】只含有正常Pax6 paird domain前102個氨基酸的Pax610Neu，仍然可以在黑色素細胞中與MITF相互作用，同時間接調控TYR的表達，從而使黑色素細胞黑色素的生成量發生改變。

關鍵詞：Pax610Neu；Pax6；MITF；TYR；黑色素

聯系方式：聶瑞強，E-mail：ibernie@126.com。通信作者董常生，E-mail：cs_dong@sxau.edu.cn

0 引言

【研究意義】動物的毛色是動物經濟價值的重要指標之一。目前，毛紡織品的多彩主要是靠化學染料染色，對人體和環境都有危害，如果可以通過基因工程從動物自身來改變毛色，豐富動物的天然毛色，對提高毛用動物的經濟價值，以及保護人體健康和環境都有很大的好處。動物的毛色主要是由位于皮膚內的黑色素的種類和數量決定的。在黑色素生成通路中，MITF是其中的一個關鍵調控基因［1］。MITF點突變可以導致動物被毛白化［2-3］，miR-137調控MITF的表達量可以使小鼠毛色改變［4］。而Pax6可以通過調控MITF的表達來調控黑色素的生成［5-6］。【前人研究進展】BAUMER等2003年在突變小鼠中發現Pax6與Pax2的復合物對于視網膜色素上皮細胞的分化和發育是必須的［7］。朱芷葳等 2012年發現Pax3參與了黑色素細胞的增殖、分化和遷移，Pax3與色素的形成相關［8］。RAVIV 等2014年發現，Pax6在調控MITF的表達時，同時會通過另一快捷途徑向MITF發出前饋信號，使Pax6調控MITF的過程更加準確［5］。FUJIMURA等2015年通過對小鼠基因的選擇性敲除發現，在視網膜色素上皮細胞發育過程中，Pax6會與β-catenin相互作用［9］，而β-catenin是已知色素生成通路中的關鍵基因［10-11］。Pax（paired box）家族屬于轉錄因子中高度保守的家族，在脊椎動物中共包含9個成員（Pax1— Pax9），其3個保守結構域包括配對域（paireddomain，PD）、八肽域（octapeptide，OP）和同源域（homeodomain，HD）［12-13］。Pax家族廣泛參與細胞內信號的傳導過程［14］，在胚胎和神經嵴的發育過程中起重要的調控作用［15］。Pax基因在體內表達紊亂時，會使多個器官組織發育畸形［16］。Pax6是由PD和HD組成，Pax 基因中，編碼PD的序列非常保守，是其作為轉錄因子與其調控基因相互作用的主要功能域，而PD是由氨基端（PAI）和羧基端（RED）兩個亞結構域連接組成的（PAI+ RED=PAIRED），PAI直接和其調控基因相互作用，RED則輔助Pax因子與目標基因的相互連接；在其家族進化過程中，編碼PAI的序列比編碼RED的序列的保守性高，種間差異小［16-17］。FAVOR等在2001年對小鼠Pax6進行以表型為基礎的試驗，發現了9 個Pax6的突變體（Pax62Neu—Pax610Neu），其中7個在轉錄時提前終止且小鼠表型上沒有變化。Pax610Neu就是其中之一。Pax610Neu在堿基對發生替換時，在paired box的羧基端產生了一個終止密碼子，這個突變體產物包含正常 Pax6前 102個氨基酸，丟失了paired domain的最后43個氨基酸，以及連接區域、同源域和P/S/T region［18］。【本研究切入點】由于編碼PD的序列十分保守，是Pax 蛋白與DNA 結合的主要功能域［16］。而Pax610Neu中只包含PD高度保守的區段，那么 Pax610Neu在分子水平上是否還具有一定的作用，其是否仍然可以在黑色素細胞中與其調控的下游基因相互作用？且從未有研究以Pax610Neu為切入點來研究Pax6作為轉錄因子調控下游基因的具體功能位點。這對研究Pax6的功能位點，以及對動物毛色形成機理的研究都有重要的意義。【擬解決的關鍵問題】本試驗在細胞水平上通過細胞轉染技術過量表達 Pax610Neu，以探究 Pax610Neu是否仍與MITF和TYR相互作用。

1 材料與方法

試驗于2015年1—10月在山西農業大學羊駝生物工程實驗室完成。

1.1 材料

試劑：DMEM培養基（Life，美國）、黑色素細胞培養基（Sciencell，美國）、Trizol（Invitrogen，美國）、RT-PCR kit（康為，北京）、MITF多克隆抗體、TYR多克隆抗體、RIPA蛋白裂解液（碧云天，北京）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠 Pax610Neu基因序列的獲取 通過 NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）來查找獲得。

1.2.2 小鼠Pax610Neu基因片段的克隆 使用Trizol法提取小鼠皮膚總RNA，使用反轉錄試劑盒合成相應的cDNA。設計Pax610Neu基因引物（表1），送華大基因公司合成。使用普通PCR擴增目的基因，膠回收后送華大基因公司雙向測序確認。

1.2.3 Pax610Neu基因真核表達載體的構建 首先使用連有SalⅠ、XbaⅠ酶切位點的Pax610Neu基因與T載體相連，測序成功后，將Pax610Neu基因用SalⅠ、XbaⅠ酶切下，膠回收后，再連接啟動子為黑色素細胞特異性啟動子小鼠 tyrp2的慢病毒載體（載體為實驗室保存）。

1.2.4 細胞培養 試驗所用細胞為實驗室保存的第6代綿羊黑色素細胞。將細胞從液氮中取出，置于37℃水浴鍋中，使其快速溶解。復蘇后的細胞接種于加有黑色素細胞培養基的6孔板上，在37℃、5％ CO2培養箱中培養。

1.2.5 細胞轉染 設置正常組、空載組和試驗組，在6孔板的每孔加入大約1.8 mL含血清的正常培養基，接種1×106個細胞，培養細胞至鋪滿底部75％；正常組為正常培養的黑色素細胞，空載組和試驗組中的細胞，在傳代1 d后，加入轉染試劑與表達載體形成的脂質體，混勻，37℃培養24 h，吸去含有轉染試劑的培養基，每孔加入1.8 mL 含血清的正常培養基。在37℃條件下培養細胞48 h，進行轉染結果檢測。

表1　試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 黑色素含量測定 用胰酶將黑色素細胞從細胞培養板上消化下來，用PBS清洗3 次后細胞計數。用0.2 mol·L-1NaOH（1×106cells/mL）溶解細胞，使用酶標儀在475 nm 波長進行測值［19］。用黑色素標準品做標準曲線，每組重復3次。

1.2.7 Real-time PCR檢測 使用Trizol法提取細胞RNA，并使用反轉錄試劑盒獲得cDNA。由于Pax610Neu基因序列長度只有309 bp，故直接使用普通PCR引物作為熒光定量PCR引物（表1），且通過試驗其效果良好。根據熒光定量PCR結果的CT 值計算試驗結果，目的基因的相對表達水平=2-△△CT，所有數據用GraphPad Prism5.0進行統計分析，實時熒光定量PCR結果均用均值±標準誤（Means ± SEM）表示，其中各基因的表達量均經β-actin校正，兩組之間的數據比較全部采用GraphPad Prism5.0 統計軟件進行t檢驗，3組之間的比較全部采用單因素方差分析。

1.2.8 蛋白免疫印跡試驗 用RIPA蛋白裂解液提取黑色素細胞蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，后轉至NC膜。MITF和TYR抗體所用濃度為1000倍稀釋。孵育二抗后，用ECL顯色后暗室曝光，獲得有條帶的膠片，分析。用Image-ProPlus 6.0 軟件對綿羊MITF、TYR和β-actin 結果進行條帶面積和灰度值半定量分析，數據均用Means ± SEM 表示，兩組之間的數據比較全部采用GraphPad Prism5.0 統計軟件進行t檢驗，3組之間的比較全部采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠Pax610Neu基因序列的獲得

小鼠Pax610Neu基因mRNA在GeneBank中的編號為AJ307468.1。

2.2 小鼠 Pax610Neu氨基酸序列與綿羊 Pax6氨基酸序列比對

經過小鼠與綿羊Pax6蛋白質（XP_011951552.1）前102個氨基酸序列的比對，發現小鼠Pax610Neu氨基酸序列與綿羊Pax6前102個氨基酸序列的相似性為99.02％（圖 1）。故通過綿羊黑色素細胞來驗證小鼠Pax610Neu是否還有其生物學功能是可行的。

2.3 Pax家族氨基酸序列比對

Pax家族的 9個成員的氨基酸序列同源性為32.56％。Pax6的保守區域主要集中于前130個氨基酸處，而Pax610Neu的氨基酸序列為其保守區的前102個氨基酸（圖2），故Pax610Neu很可能還保留有Pax6的生物學功能。

圖1　Pax610Neu氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequence of Pax610Neu

圖2　小鼠PAX家族氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of PAX family of mouse

2.4 Pax610Neu真核表達載體構建

PCR純化的Pax610Neu基因被連接到含有可在黑色素細胞內特異表達的小鼠 tyrp2啟動子的慢病毒質粒載體中，同時該載體連接有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（圖3）。

連接后的表達載體送華大基因公司進行了測序，結果完全符合預期大小，并且通過比對在NCBI中找到了與Pax610Neu序列完全一致的區域。

2.5 黑色素細胞的培養

細胞接種12 h后，即可見細胞貼壁伸展，24 h后細胞呈典型的樹突狀（圖4-A， B）。

2.6 質粒真核表達載體在黑色素細胞中的轉染

2.6.1 黑色素細胞轉染效率檢測 在黑色素細胞對數生長期進行轉染，并且通過綠色熒光的觀察（圖4-C，D，E，F）和RT-PCR來檢測轉染效率，結果可以表明試驗構建的真核表達載體可以在黑色素細胞中正常表達且通過熒光定量 PCR發現，試驗組中 Pax610Neu被極顯著的提高（P＜0.001）（圖5）。

圖3　Pax610Neu真核表達載體Fig. 3 Structure of over-expressing Pax610Neu

圖4　黑色素細胞培養和轉染熒光圖Fig. 4 The pictures of cell culture and green fluorescence

2.6.2 Western blot 檢測MITF、TYR蛋白在轉染后黑色素細胞中的表達 提取轉染后黑色素細胞的蛋白質，使用Western blot檢測后，通過統計分析獲得結果顯示（圖6），與正常組相比，試驗組MITF蛋白顯著升高8.24倍，TYR蛋白顯著升高2.09倍。由此得出，Pax610Neu可以顯著提高MITF、TYR蛋白的產生（P＜0.001）。

2.6.3 轉染后黑色素細胞MITF和TYR mRNA表達量檢測 提取轉染后黑色素細胞的 RNA后，通過熒光定量PCR檢測，結果顯示（圖7）：與正常組相比，試驗組MITF mRNA顯著升高3.2倍（P＜0.05），TYR mRNA升高1.31倍。由此得出，Pax610Neu可以顯著促進MITF mRNA的產生，對TYR mRNA的影響不顯著。

2.6.4 轉染后黑色素含量測定 收集黑色素細胞，用酶標儀對黑色素含量進行測定，結果顯示，轉染后的黑色素細胞中，試驗組黑色素含量是空白組的1.22倍（P＜0.05）（圖8）。

圖5　Pax610Neu轉染黑色素細胞的效率Fig. 5 Pax610NeumRNA levels in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure

圖6　Pax610Neu轉染后黑色素細胞MITF、TYR蛋白的表達量Fig. 6 Western blot analysis of MITF， TYR expression in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure and vector control

圖7　轉染Pax610Neu后黑色素細胞的MITF和TYR mRNA檢測Fig. 7 Real-time PCR analysis of MITF，TYR expression in melanocytes transfected with the Pax610Neustructure

圖8　過表達Pax610Neu對黑色素細胞黑色素生成的影響Fig. 8 Melanin production in melanocytes over-expressing Pax610Neustructure

3 討論

本試驗在分子水平上，通過細胞轉染技術，構建Pax610Neu真核表達載體，研究Pax6調控黑色素生成的調節機制。試驗通過Western bolt以及RT-PCR對黑色素細胞中的MITF和TYR進行檢測，同時對黑色素細胞中黑色素含量進行測定，結果顯示Pax610Neu的高表達可以促進MITF的表達，并通過MITF調控促進了 TYR的表達，進而影響黑色素細胞生成黑色素的量。這個結果為進一步研究 Pax6的功能域以及與MITF作用的功能區域提供了基礎。

FAVOR等發現Pax6的突變體Pax610Neu，并通過小鼠的表現型驗證其為無效等位基因，從而得出Pax6功能的發揮需要全部的功能域都完整［18］，但是，通過本次試驗結果得出，只含有正常Pax6 paird domain 的前102個氨基酸的Pax610Neu也可以與MITF相互作用，從而促進MITF和TYR的表達。序列比對結果顯示，Pax610Neu含有多個paired domain的保守序列，所以可以推斷 Pax6與 MITF的作用位點很可能是在 paired domain高度保守的區域。

MAZUR在2013年發現Pax6通過與MITF相互作用來調節色素細胞的分化［20］。MITF具有堿性的螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈結構［21］，調控皮膚和視網膜色素細胞特異性基因的表達［22-23］。同時，在視網膜色素上皮細胞的發育中，Pax6也調控黑色素生成通路中Wnt/β-catenin通路的β-catenin［24-25］。

在生命進化過程中，生物大分子之間的相互作用和調控有多種多樣的方式，包括實驗證實的和未證實的，Pax6在黑色素細胞中的作用機理，及其結構的不完整性對其作用的影響還有待于進一步的研究。

4 結論

只含有正常Pax6 paird domain前102個氨基酸的Pax610Neu仍然可以在黑色素細胞中與MITF相互作用，從而間接調控TYR的表達量，進而調節黑色素細胞黑色素的生成。

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（責任編輯 林鑒非）

The Influences of Over-Expressing Pax610Neuon MITF and TYR in Melanocytes

NIE Rui-qiang1， YANG Yu-jing1， XIE Jian-shan1，2， FAN Rui-wen1， GAO Wen-jun1， DONG Chang-sheng1
（1College of Animal Science and Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi；2School of Basic Medical Sciences， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001）

Abstract：【Objective】 MITF and β-catenin are important regulatory genes of the melanin system. Pax6 regulates the production of melanin indirectly， through regulates MITF and TYR. In order to explore the function of Pax610Neuand the mechanism of Pax6 with its target genes， we explored the function of Pax610Neu， which only included 102 N-terminalanimo acids of the paird domain. 【Method】 According to the sequence of Pax610Neuin NCBI， the primers of Pax610Neuwere designed and synthesized byBGI. The coding sequences of Pax610Neuwere PCR amplified and then confirmed by sequencing. Sal I and Xba I restriction sites were selected by analyzing the sequences of Pax610Neuand the mammalian expression vector. The Pax610Neuwas cloned into the T-Vector， meanwhile， confirmed by sequencing. The fragment was then subcloned into a mammalian expression vector， resulting in a construction that contained a specific mouse tyrp2 promoter driving the expression of the green fluorescent protein （GFP） and the target fragment with Sal I and Xba I restriction sites. The plasmid vector was confirmed by sequencing. The expression vector was amplified by competent cells and obtained without endotoxin by the plasmid midiprep system. Then， the sheep melanocytes were transfected with the vector using Liposome 2000. There were three methods used in the results test which were quantitatively real-time PCR， western blot， and melanin content measurement. 【Result】 The results showed that the MITF mRNA， MITF and TYR protein， melanin content were significantly increased. MITF mRNA was significantly increased to 3.2 times （P＜0.05） and TYR mRNA was increased to 1.31 times， compared with control group， MITF protein was significantly increased to 8.24 times （P＜0.001） and TYR protein was significantly increased to 2.09 times （P＜0.001）. Meanwhile， the melanin content was significantly increased to 1.22 times （P＜0.05）. 【Conclusion】 We demonstrated that the Pax610Neustill interacts with MITF， and then regulated TYR indirectly， meanwhile changing the production of melanin of melanocytes.

Key words：Pax610Neu； Pax6； MITF； TYR； melanin

收稿日期：2015-10-28；接受日期：2015-12-25

基金項目：國家高科技研究發展計劃（863計劃）（2013AA102506）、國家公益性行業（農業）科研專項（201303119）、山西農業大學創新團隊