高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究

羿 菲，李小曼，白 寧，孫 威，姜 波，張 瑩，宋曉宇

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·論著·

高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究

羿 菲，李小曼，白 寧，孫 威，姜 波，張 瑩，宋曉宇

110122遼寧省沈陽市，中國醫科大學轉化醫學研究院

【摘要】目的建立體外穩定過表達酸敏感離子通道1a(ASIC1a)的Fisher大鼠甲狀腺上皮細胞(FRT細胞)，采用Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細胞毒性檢測〔乳酸脫氫酶(LDH)釋放法〕測定ASIC1a活性，探討高通量篩選ASIC1a抑制劑的可行性。方法2014年1月—2016年2月，利用分子生物學方法，構建ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a，通過細胞轉染技術建立了穩定過表達ASIC1a的Fisher大鼠FRT細胞。將細胞分成兩組，對照組(FRT細胞)和實驗組(穩定過表達ASIC1a的FRT細胞)，并分別未負載和負載Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM，采用酶標檢測儀測定雙波長(340 nm和380 nm)的值，計算F340/F380。對照組和實驗組細胞經不同pH值酸液(pH值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后，采用酶標檢測儀測定450 nm波長處LDH釋放量。結果對照組與實驗組未負載Fura-2/AM細胞F340/F380比較，差異無統計學意義(P>0.05)；實驗組負載Fura-2/AM細胞F340/F380較對照組升高(P<0.05)；對照組和實驗組負載Fura-2/AM細胞F340/F380較未負載Fura-2/AM細胞升高(P<0.05)。pH值6.5、6.0、5.5時，實驗組細胞LDH釋放量大于對照組(P<0.05)；對照組和實驗組細胞不同pH值時LDH釋放量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論本研究成功建立穩定過表達ASIC1a的FRT細胞，Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細胞毒性檢測(LDH釋放法)兩種方法測定ASIC1a活性，使高通量篩選ASIC1a抑制劑成為可能，為發現高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑奠定了基礎。

【關鍵詞】高通量篩選分析；酸敏感離子通道1a；上皮細胞；乳酸脫氫酶

羿菲，李小曼，白寧，等.高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究[J].中國全科醫學，2016，19(17)：2033-2037.[www.chinagp.net]

Yi F,Li XM,Bai N,et al.High thoughtout screening of ASIC1a inhibitors[J].Chinese General Practice，2016，19(17)：2033-2037.

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一類由細胞外酸化激活的陽離子通道，廣泛分布于外周神經系統、中樞神經系統、消化系統等器官及部分腫瘤組織中。參與輕觸覺、酸味覺、痛覺形成，在缺血性腦損傷、學習與記憶等多種生理及病理過程中發揮重要作用[1-3]。其中ASIC1a同聚體通道對H+敏感性較高，但只表現出快速失活成分。ASIC1a電流對離子的選擇性依次為pNa+>pLi+>pCa2+>pK+>pCs+[4-5]。研究發現，ASIC1a介導的Ca2+超載在腦卒中引起的神經元損傷機制中具有重要作用[6-7]。那么研發特異有效的小分子ASIC1a抑制劑就成為治療缺血性腦損傷的分子靶向。阿米洛利(amiloride)及其類似物是目前已知的一大類小分子ASICs抑制劑，但無選擇性、抑制作用小和不良反應大等缺點導致其只能在實驗研究中起作用[8-10]。而蜘蛛毒素(PcTx1)能特異性地抑制ASIC1a，比N-甲基-M天冬氨酸受體(NMDARs)拮抗劑具有更長時間的保護作用，但在臨床應用上仍然具有困難[11]，那么研發高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑成為當今研究的熱點。通常檢測ASIC1a功能的方法是應用全細胞膜片鉗技術記錄ASIC1a的開關電流，但耗時長、效率低，無法實現高通量篩選[6]，所以本研究將探索適合于篩選高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑的高通量篩選方法，為腦卒中的靶向治療奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料2014年1月—2016年2月，Fisher大鼠甲狀腺上皮細胞(FRT細胞)購于ATCC，以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基(Gibco)培養于37 ℃、5% CO2環境中。熒光二抗Alexa fluo 594、Lipofectamine 2000均購于Invitrogen公司，C-myc抗體和Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM均購于Sigma，乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。細胞毒性檢測(LDH釋放法)溶液：溶液A(pH值為7.5和7.0)500 ml：150 mmol/L氯化鈉(NaCl)4.38 g，5 mmol/L氯化鉀(KCl)0.19 g，1 mmol/L氯化鎂(MgCl2)0.1 g，2 mmol/L氯化鈣(CaCl2)0.15 g，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)1.19 g，10 mmol/L葡萄糖 0.9 g，用氯化氫(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)調制適當的pH值；溶液B(pH值為6.5、6.0

本研究背景和創新點：

酸敏感離子通道1a(ASIC1a)介導的Ca2+超載在腦卒中引起的神經元損傷機制中具有重要作用，研發高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑成為當今治療腦卒中的關鍵，但目前仍未得到解決。全細胞膜片鉗技術能很好地記錄ASIC1a的開關電流，但此方法不能應用于高通量篩選研究。本研究構建了穩定過表達ASIC1a的Fisher大鼠甲狀腺上皮細胞(FRT細胞)，分析Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細胞毒性檢測(乳酸脫氫酶釋放法)兩種方法在高通量篩選應用中的可行性，為得到高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑提供可能。

和5.5)500 ml：150 mmol/L NaCl 4.38 g，5 mmol/L KCl 0.19 g，1 mmol/L MgCl20.1 g，2 mmol/L CaCl20.15 g，10 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) 0.98 g，10 mmol/L葡萄糖 0.9 g，用HCl或NaOH調制適當的pH值。

1.2方法

1.2.1ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的構建根據分子克隆實驗指南中重組載體的方法[12]，采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法克隆ASIC1a基因，ASIC1a上游引物為5′-CCCAAGCTTAGCATGGAACTGAAGACCGAG-3′,下游引物為5′-GCTCTAGAGCAGGTAAAGTCCTCAAACG-3′。瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收DNA片段，并與pcDNA3.1/myc-His載體(購于Invitrogen)分別進行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切，回收載體片段后，利用T4 DNA連接酶在16 ℃條件下，過夜連接，并轉化，挑取單克隆進行測序鑒定。

1.2.2穩定過表達ASIC1a的FRT細胞的建立FRT細胞轉染前24 h內采用胰酶消化，以70%～80%的密度鋪到6孔板。將pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a按照Lipofectamine 2000說明書步驟操作，瞬時轉染到FRT細胞中，并進行新霉素(neomycin)篩選(濃度為500 mg/L)，獲得穩定過表達ASIC1a的FRT細胞。

1.2.3細胞免疫熒光染色將穩定過表達ASIC1a的FRT細胞去掉培養基，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。4%多聚甲醛溶液室溫下固定20 min后，采用0.05%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)進行細胞膜穿孔15 min。2% BSA封閉液室溫下封閉1 h。加入鼠源C-myc抗體(1∶1 000)室溫2 h或4 ℃過夜。采用PBS洗滌3次，15 min/次。羊抗鼠熒光二抗Alexa fluo 594(1∶500)室溫下反應1 h。去除二抗工作液，采用PBS洗滌3次，15 min/次。封固，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.4Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性(1)將細胞分成兩組，對照組(FRT細胞)和實驗組(穩定過表達ASIC1a的FRT細胞)，FRT細胞和穩定過表達ASIC1a的FRT細胞分別按約15 000個細胞/孔的密度鋪于黑壁透明底的96孔板上，培養24 h。用PBS洗滌3次后加入0 μmol/L或2 μmol/L Fura-2/AM，37 ℃孵箱避光負載40 min。用含0.2% BSA的PBS洗滌3次，充分除去細胞外的Fura-2/AM。(2)Fura-2/AM無Ca2+結合能力，最大發射波長為510 nm，最大激發波長為380 nm，負載液的熒光光譜基本上同于此。Fura-2/AM與細胞內游離的Ca2+結合形成Fura-2-Ca2+復合物，最大激發波長從380 nm漂移到340 nm，固定發射波長510 nm，采用FluoStar Optima多功能酶標儀測定雙波長(340 nm和380 nm)的值，計算F340/F380。實驗重復5次。

1.2.5細胞毒性檢測(LDH釋放法)測定ASIC1a活性將細胞分成兩組，對照組(FRT細胞)和實驗組(穩定過表達ASIC1a的FRT細胞)。按照LDH釋放檢測試劑盒說明書方法檢測不同pH值酸液(溶液A、溶液B)(pH值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后細胞LDH釋放量。LDH釋放法具體步驟：空白孔：雙蒸水25 μl，基質緩沖液25 μl；標準孔：雙蒸水5 μl，0.2 mmol/L標準液20 μl，基質緩沖液25 μl；測定孔：待測樣本20 μl，基質緩沖液25 μl，輔酶I 5 μl；對照孔：雙蒸水5 μl，待測樣本20 μl，基質緩沖液25 μl。混勻，37 ℃溫浴15 min。空白孔、標準孔、測定孔、對照孔分別加入2,4-二硝基苯肼25 μl，混勻，37 ℃溫浴15 min?？瞻卓?、標準孔、測定孔、對照孔分別加入0.4 mol/L NaOH溶液250 μl，混勻，室溫放置5 min，每個樣本取200 μl，波長450 nm處，酶標儀測定吸光度(OD值)。實驗重復5次。

2結果

2.1ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的構建以實驗室已存的小鼠腦cDNA為模板，應用ASIC1a特異引物擴增出1條1 580 bp mASIC1a條帶(見圖1A)，經HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后目的基因mASIC1a片段和pcDNA3.1/myc-His(見圖1B)。ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a用ASIC1a特異引物經PCR擴增出1條1 580 bp左右的基因片段(見圖1C)，說明ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a構建成功。

注：M=marker,ASIC1a=酸敏感離子通道1a；A：ASIC1a的PCR擴增產物；B：HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后擴增產物；C：ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的PCR擴增產物

圖1ASIC1a過表達載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的PCR擴增產物

Figure 1The PCR amplification product of ASIC1a overexpression vector pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a

2.2穩定過表達ASIC1a的FRT細胞的建立將pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a轉染入FRT細胞，應用免疫熒光方法觀察ASIC1a在FRT細胞中的表達情況。免疫熒光結果顯示，ASIC1a表達在FRT細胞的細胞膜上，并且ASIC1a表達純度很高(見圖2)，篩選成功，可以應用于后續實驗研究。

2.3Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性對照組與實驗組未負載Fura-2/AM細胞F340/F380比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組與實驗組負載Fura-2/AM細胞F340/F380比較，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和實驗組負載Fura-2/AM細胞F340/F380高于未負載Fura-2/AM細胞，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM and cells not loaded with Fura-2/AM calcium between control group and experiment group

組別未負載Fura-2/AM負載Fura-2/AMt值P值對照組0.37±0.064.86±0.3811.54<0.01實驗組0.41±0.058.70±0.2631.45<0.01t值0.538.28P值0.61<0.01

圖2穩定過表達ASIC1a的FRT細胞免疫熒光染色(×40)

Figure 2FRT cell immunity fluorescence staining with stable ASIC1a overexpression

2.4細胞毒性檢測(LDH釋放法)測定ASIC1a活性pH值7.5、7.0時，對照組與實驗組細胞LDH釋放量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；pH值6.5、6.0、5.5時，實驗組細胞LDH釋放量大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和實驗組細胞不同pH值時LDH釋放量比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

3討論

本研究通過建立穩定過表達ASIC1a的FRT細胞，應用Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性，發現穩定過表達ASIC1a的FRT細胞F340/F380升高，可以作為高通量篩選ASIC1a抑制劑的方法之一。酸中毒機制是通過激活ASIC1a，引起Ca2+超載，導致細胞中毒乃至死亡。目前，常用有效的檢測細胞毒性的方法是通過測定LDH釋放量來反映細胞中毒程度。本研究發現,pH值下降，穩定過表達ASIC1a的FRT細胞LDH釋放量增加，為進一步高通量篩選ASIC1a抑制劑提供可能。

缺血性腦損傷是一個由多因素參與、多蛋白相互調控的過程。研究者普遍認為“興奮毒性”和“酸毒性”是引起缺血性腦損傷的兩個重要的機制，過量的谷氨酸激活NMDARs導致大量Ca2+內流，從而激活了CaMKⅡ，CaMKⅡ又依次調節NMDARs和ASIC1a的磷酸化[6]。缺血過程中，NMDARs的激活又增強了ASIC1a同聚體和包含ASIC1a的異聚體通道通透Ca2+和Na+的電流[6]。由此可見，在腦缺血期間，興奮性中毒和酸中毒存在著功能上的協同作用，最終導致神經元的死亡。盡管對缺血性腦卒中的細胞與分子反應的研究已取得了巨大的進展，但仍無有效的治療措施[6]。隨著谷氨酸受體拮抗劑在臨床上應用的失敗，研發ASICs的有效抑制劑必然成為治療缺血性腦卒中的新靶點。

ASIC1a是導致缺血性腦損傷的重要分子機制。細胞外酸化激活ASIC1a通透Ca2+，導致細胞內Ca2+超載，引起神經元中毒損傷[6]。本研究首先根據細胞的特性、貼壁性以及是否能應用于高通量篩選等方面選擇FRT細胞作為工具細胞，并建立了穩定過表達ASIC1a的FRT細胞。目前檢測ASIC1a功能的方法是應用全細胞膜片鉗技術記錄ASIC1a的開關電流，但此技術不適于高通量篩選大規模藥物，耗時長、效率低[6]，所以探索合適的高通量篩選方法就顯得尤為重要。本研究探索兩種測定方法：(1)Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM，優點是具有高熒光強度、高靈敏度、誤差小、低親和力，能實時監測Ca2+濃度的變化，但易出現探針泄漏、房室化、受其他二價陽離子干擾、耗費大等現象。(2)細胞毒性檢測(LDH釋放法)，優點是經濟、快速、簡便、適用范圍廣，可做定量測定，具有大量樣本快速檢測的優點。但LDH是細胞本身生長代謝的產物,可能存在自發釋放現象，并且LDH分子較大，當細胞膜嚴重破損時才能被釋放，故不能較早地反映細胞的功能，另外較高濃度的胎牛血清中所含的LDH、培養液中的丙酮酸鹽都可能會干擾結果[13]。本研究應用以上兩種方法均得到了較好的實驗結果，為發現高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑奠定了基礎，為研究缺血性腦卒中誘發神經元損傷的機制和治療提供理論基礎。

表2　對照組與實驗組不同pH值時細胞LDH釋放量比較±s，n=5)

注：與同組pH值7.5時比較，aP<0.05；與同組pH值7.0時比較，bP<0.05；與同組pH值6.5時比較，cP<0.05

綜上所述，本研究對比分析FRT細胞和穩定過表達ASIC1a的FRT細胞中Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定的F340/F380和細胞毒性檢測(LDH釋放法)測定的LDH釋放量，這兩種方法均可以作為高通量篩選高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑的功能方法。由于ASIC1a是快速轉運Ca2+通道，Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細胞毒性檢測(LDH釋放法)方法對Ca2+快速變化的敏感性、受其他因素干擾情況以及人為誤差等因素仍存在諸多不明確性，還需后續實驗進一步優化，從而為研發高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑提供新思路和新方法。

作者貢獻：羿菲、宋曉宇構思并設計實驗、分析數據、撰寫論文、并對文章負責；李小曼進行資料收集整理；白寧、孫威、姜波、張瑩進行實驗實施和評估；宋曉宇負責文章審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

High Thoughtout Screening of ASIC1a Inhibitors

YIFei,LIXiao-man,BAINing,etal.

InstituteofTranslationalMedicine,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China

【Abstract】ObjectiveTo establish the FRT cell of Fisher rats of stable in vitro ASIC1a overexpression,Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM and cytotoxicity test(LDH releasing method) were used to determine the activity of ASIC1a,to discuss the feasibility of high throughput screening of ASIC1a inhibitors.MethodsFrom January 2014 to February 2016,molecular biology method was used to establish ASIC1a overexpression vector pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a.By cell transfection technique,we established FRT cell of Fisher rats with stable ASIC1a overexpression.The cells were divided into two groups:control group(FRT group) and experiment group(FRT cells with stable ASIC1a overexpression);two groups were loaded or not loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM,and enzyme mark detector was employed to determine dual-wave length(340 nm and 380 nm) and the ratio of F340/F380.After the cells in control group and experiment group were stimulated by acid liquid of different pH values(7.5,7.0,6.5,6.0 and 5.5),the LDH release at 450 nm wave length was determined using enzyme mark detector.ResultsControl group and experiment group were not significantly different in F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM(P>0.05);experiment group was higher than control group in F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM(P<0.05);control group and experiment group had higher F340/F380 in cells loaded with Fura-2/AM than in cells not loaded with Fura-2/AM(P<0.05).When pH value were 6.5,6.0 and 5.5,experiment group was higher than control group in LDH release(P<0.05);control group and experiment group were significantly different in LDH release in the cases of different pH values(P<0.05).ConclusionStable ASIC1a overexpression cells are established,and Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM and cytotoxicity test(LDH releasing method) are used to determine the activity of ASIC1a,which make the high thoughtout screening of ASIC1a inhibitors possible and lay a foundation for finding natural small molecule ASIC1a inhibitors with specificity and high activity.

【Key words】High-throughput screening assays；Acid-sensing ion channels1a；Epithelial cells；Lactate dehydrogenase

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81502414)；教育部“創新團隊發展計劃”資助項目(IRT13101)

通信作者：宋曉宇，110122遼寧省沈陽市，中國醫科大學轉化醫學研究院；E-mail:xysong@mail.cmu.edu.cn

【中圖分類號】R 965.1

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.17.011

(收稿日期：2016-03-01；修回日期：2016-05-10)