豬細小病毒、豬偽狂犬病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應用

文 / 山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝 沈志強山東省濱州畜牧獸醫研究院 王金良 莫 玲

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豬細小病毒、豬偽狂犬病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應用

文 / 山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝 沈志強
山東省濱州畜牧獸醫研究院 王金良 莫 玲

摘 要根椐GenBank中等錄的豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環病毒2型(PCV2)病毒核苷酸序列，分別設計3對引物，在建立各病毒單項PCR技術的基礎上，優化多重PCR反應條件，建立了3種病毒的多重PCR檢測方法，用這3對引物對同一樣品中的PPV、PRV、PCV2核酸模板進行多重PCR擴增，結果可同時擴增PPV的475bp，PRV的689bp，PCV2的245bp的特異性片段，而對其他4種病原的PCR擴增結果均為陰性。敏感性測定結果表明，該多重PCR技術能檢出10pg的PPV、10pg的PRV和1pg的PCV2模板。用65份臨床病料對本研究多重PCR技術和單項PCR技術進行對比驗證，結果顯示：兩者的總符合率為100%。表明建立的多重PCR檢測方法，具有特異、快速、準確的特點，可用于對這三種病毒的同時檢測、鑒別和診斷。

關鍵詞多重聚合酶鏈式反應；豬細小病毒；豬偽狂犬病毒；豬圓環病毒2型

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)會導致感染母豬產出死胎、畸形胎、木乃伊胎及產出的仔豬病弱[1]。豬偽狂犬病毒(Porcine Pseudorabies Virus，PRV)可導致妊娠母豬流產、死產、木乃伊胎，初生仔豬具有明顯的神經癥狀，死亡率幾乎100%[2]。豬圓環病毒2型(Porcine Circovirus 2，PCV2)與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫等癥狀密切相關[3]。因此，這三種病毒均是豬繁殖障礙類疾病的病原體，單純根據臨床癥狀不能鑒別診斷，且三者在臨床上常呈混合感染。當同時感染兩種或三種病原時，臨床癥狀加重，將給養豬業造成巨大的經濟損失[4,5]。建立高效、快速、敏感的診斷方法對該3種豬病的防控非常關鍵。針對這3種病原傳統檢測方法耗時長、檢測敏感性較低及準確性差等。PCR檢測方法以檢測快度、靈敏度高、特異性好等特點已經廣泛應用于多種疾病的檢測，多重PCR技術是在常規PCR基礎上發展起來的一種檢測技術，在一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR診斷技術，具有簡便、快速、敏感、特異、易于操作和鑒別多種病原的等優點，即可以節約時間，又可以節省人力和物力[6]，適合大量臨床樣品(特別是混合感染樣品)中病原體的快速診斷。本文選擇PPV VP2、PRVgD和PCV2、ORF2保守基因序列設計引物，優化了反應條件，建立一種可用于上述3種病毒的多重PCR診斷方法，并對臨床病料進行檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍耳病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室提供。

1.2 工具酶及試劑盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、RNasin、dNTPs、DL2000 Marker等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司，其他化學試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等，均為國產分析純產品。

1.3 引物的設計與合成

參考GenBank中登錄的PPV(JQ710901)、PRV(KF017337)和PCV2(DQ104423)基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設計3對特異性引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用滅菌水溶解并配成15pmol/mL溶液備用。

1.4 病毒基因組的提取

取感染PPV、PRV、PCV2的細胞培養液，反復凍融3次，經12,000 rpm離心20 min，取上清作為待測樣品。按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書分別提取提取PPV、PRV、PCV2的DNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 反應條件優化

最適退火溫度的確定：分別以50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃的退火溫度進行梯度PCR反應，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。

最適引物濃度的確立：在25μL PCR反應體系中分別以0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/ μL、0.8pmol/μL和1.0pmol/μL的引物濃度進行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物濃度，篩選出多重PCR反應體系的最佳反應模式。

1.6 特異性試驗

用已建立的多重PCR擴增，分別對PPV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV和JEV 的模板進行擴增，擴增反應同時設雙蒸水陰性對照，擴增反應結束后進行凝膠電泳檢測，以檢驗多重PCR的特異性。

1.7 多重PCR的敏感性試驗

分別提取PPV、PRV和PCV2的DNA，用儀器測定含量，并依次做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取lμL為模板，采用已優化的多重PCR反應條件分別對上述不同稀釋度的DNA 進行多重PCR擴增，反應結束后進行凝膠電泳檢測，以檢測建立的多重PCR的敏感性。

1.8 重復性試驗

用建立的多重PCR檢測方法分別對PPV感染的8份陽性樣品，PRV感染6份陽性樣品，PCV2感染的5份陽性樣品及5份陰性樣品重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對山東、河南、江西、福建、四川和吉林等省65份送檢疑似病料進行多重PCR檢測。

表1 PPV、PRV和PCV2 基因擴增引物

2 結果與分析

2.1 反應條件的優化

通過對PPV、PRV和PCV2 3種引物濃度及多重PCR擴增溫度、時間和循環次數等的優化，最后確定多重PCR中最佳引物濃度分別為PPV 0.4pmol/μL、PRV 0.6pmol/μL、PCV2 0.6pmol/μL，多重PCR的最佳反應模式為：94℃ 5 min，94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45 s，30個循環，最后 72℃ 延伸10 min。

2.2 擴增產物的檢測

將PPV、PRV和PCV2的核酸分別進行多重PCR擴增，結果能擴增出與預期相符，PCV2的245bp，PPV的475bp，PRV的689bp的特異性片段，而對照組擴增不出任何條帶，其擴增產物的電泳結果見圖1。

2.3 特異性試驗

采用建立的多重PCR方法對PPV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV和JEV在相同的條件進行擴增。結果顯示，PPV、PRV和PCV2的PCR產物的片段長度分別為475bp、 689bp和245bp，與預期大小一致，而CSFV、PRRSV、PEDV和JEV均未擴增出片段，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，說明本研究建立的多重PCR方法特異性強。

M：DL2000 MarKer，1：PPV PCR產物，2：PRV PCR產物，3：PCV PCR產物，4～5：3對引物的空白對照。圖1 單項PCR擴增結果

2.4 敏感性試驗

提取PPV、PRV、PCV2基因組DNA，用儀器測定含量，然后做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1μL，作為模板。結果顯示用10pg的PPV、10pg的PRV、1pg的PCV2可以擴增出特異性條帶(見圖3)。表明該多重PCR敏感性強。

M：DL2000 MarKer，1:PPV+PRV+PCV2，2:PPV+ PCV2，3:PRV+ PCV2，4:PPV +PRV，5:CSFV，6：PRRSV，7:PEDV，8:JEV，9:空白對照。圖2 三重PCR的特異性試驗

2.5 重復性試驗

M：DL2000 MarKer，1：100ng PPV+100ng PRV+100ng PCV2，2：10ng PPV+10ng PRV+10ng PCV2，3：1ng PPV+1ng PRV+1ng PCV2，4：100pg PPV+100pg PRV+100pg PCV2，5：10pg PPV+10pg PRV+10pg PCV2，6：1pg PPV+1pg PRV+1pg PCV2，7：100fg PPV+100fg PRV+100fg PCV2，8：10fg PPV+10fg PRV+10fg PCV2，9：空白對照。圖3 三重PCR的敏感性試驗

表2 被檢病料單項PCR與多重PCR檢測對比試驗結果

經過3次重復操作，結果一致，表明本研究建立的多重PCR方法是穩定可靠的。

2.6 臨床樣品的檢測

對65份在不同地區采集的疑似病料，用建立的多重PCR和單項PCR進行了檢測，兩者符合率達100%(見表2)，結果表明建立的多重PCR檢測體系的特異性和敏感性較好。

3 討論

在多重PCR反應中，引物的設計很重要，對多重PCR反應是否成功起著決定性的作用。

本研究分別針對PPV VP2、PRV gB和PCV2 ORF2保守基因序列設計引物，在這3種病毒中，由于PPV基因組序列的G+C含量較低，而PRV屬于皰疹病毒科，其G+C含量較高，達73%，因此，在設計引物時，將擴增PCV2、PPV、PRV這3對引物的G+C含量控制在45%～60%，這樣能確保所有的引物在相近的退火溫度進行多重PCR擴增，為成功進行多重PCR反應奠定了基礎。最后確定多重PCR中最佳引物濃度分別為PPV、 PRV和PCV2最佳引物濃度分別為0.4pmol/μL、0.6pmol/μL和0.6pmol/ μL。多重PCR的最佳退火溫度為56℃。該多重PCR方法具有良好的特異性，對PPV、PRV和PCV2的擴增片段大小分別為475bp、689bp和245bp，對CSFV、PRRSV、PEDV和JEV擴增結果均為陰性。該法敏感性高，對PPV、PRV和PCV2的最低檢測量分別為10pg、10pg和1pg。

4 結論

本研究用建立的多重PCR方法對來自山東、河南、江西、福建、四川和吉林等省的65份病料進行檢測，同時進行單項PCR檢測，結果顯示，多重PCR方法與單項PCR檢測結果符合率為100%。共檢出PPV陽性樣品8份，PRV陽性樣本22份，PCV2陽性樣品14份，二重混合感染陽性樣品8份，三重混合感染陽性樣品3份。多重PCR方法比單項PCR檢測方法可節省70%的時間和2/3的試劑用量，減少了污染環境的機會，對臨床上豬細小病毒病、豬偽狂犬病毒病和豬圓環病毒病的檢測具有較好的應用價值。

參考文獻：

[1] Mengeling WL,Lager KM,Vorwald AC.The effect of por-cine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine reproductive performance[J]Anim Reprod Sci,2000,60～61:199～210.

[2] 韓秀珍.鑒別豬偽狂犬病毒強毒檢測方法的研究進展[J].畜牧與獸醫,2014,46(3):113～116.

[3] Allan GM,McNeilly F,Cassidy JP,et al.Pathogenesis of porcine circovirus;Experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material[J].Veterinary Microbiol,1995,44 (1):49～64.

[4] 許立華,王玲,蘆銀華,等.三種豬繁殖障礙性病毒混合感染的分子生物學調查[J].中國獸醫科技,2004,34(7):40～43.

[5] 賈赟,蘆銀華,張素芳,等.豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬細小病毒混合感染的流行病學調查[J].中國病毒學, 2004,19(5):467～470.

[6] Ogawa H,Taira O,Hirai T,et al. Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections[J]. J Virol Methods,2009,160(1～2):210～214.

基金項目：山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-011-14)。