CXCR4及NDRG1蛋白在前列腺癌中的表達及其與侵襲轉移的相關性分析

平　浩　牛亦農　楊飛亞　王明帥　邢念增

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院泌尿外科，北京 100020)

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CXCR4及NDRG1蛋白在前列腺癌中的表達及其與侵襲轉移的相關性分析

平浩*牛亦農楊飛亞王明帥邢念增

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院泌尿外科，北京 100020)

【摘要】目的 探討趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)及N-myc下游調節基因1(N-myc downstream regulated gene 1， NDRG1)在前列腺癌組織及細胞系中的表達情況，明確其與前列腺癌惡性程度及轉移的關系。 方法應用免疫組織化學方法檢測CXCR4蛋白在前列腺癌(46例)、良性前列腺增生(15例)及正常前列腺組織(10例)中的表達，分析其與前列腺癌病理分級及轉移的關系。免疫印跡(Western blotting)法檢測不同前列腺癌細胞系中CXCR4及磷酸化NDRG1(pNDRG1)表達差異。結果免疫組織化學檢測發現CXCR4蛋白在前列腺癌組織(30例)中過度表達，表達率為65.2%，其表達水平與前列腺癌病理分級及Gleason評分無顯著相關性(P=0.081)，而CXCR4蛋白表達與腫瘤轉移密切相關，前列腺癌轉移患者表達率明顯高于無轉移患者，差異有統計學意義(P=0.002)。Western blotting法檢測在正常前列腺上皮細胞和不同前列腺癌細胞系中CXCR4及NDRG1蛋白表達不同，高轉移潛能的去勢抵抗前列腺癌細胞(PC3和DU145)中CXCR4表達較高，而作為轉移抑制因子的pNDRG1表達則明顯降低。結論趨化因子受體CXCR4及轉移抑制因子NDRG1可能參與調控前列腺癌的進展和轉移，對前列腺癌的臨床診斷和治療有重要價值。

【關鍵詞】前列腺癌；趨化因子受體4；N-myc下游調節基因1；轉移

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種發病率較高的男性惡性腫瘤，易發生遠處轉移，尤其是骨轉移，嚴重威脅老年患者生命健康。大量研究[1-5]證實，趨化因子及其受體在腫瘤生長轉移中發揮重要作用，其中最關鍵的因子是基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1/CXCL12)，它廣泛表達于多種細胞和組織中并參與調節各種生理病理過程。趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)是CXCL12最重要的天然受體，兩者具有高度親和力，可形成CXCL12-CXCR4生物效應軸，通過趨化因子濃度梯度促進腫瘤發生器官特異性轉移[1]。分化相關基因(N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1)是N-myc下游調節基因，其表達與腫瘤的惡性程度呈負相關，作為腫瘤抑制因子可以調控腫瘤的惡性轉化和轉移[2-3]。本研究通過觀察前列腺癌組織中CXCR4蛋白表達情況，探討其與前列腺癌惡性程度和轉移的關系，同時研究在前列腺癌細胞系中CXCR4和磷酸化NDRG1蛋白的表達，明確其在前列腺癌發展和轉移中的作用。

1材料與方法

1.1材料來源

收集2010至2015年首都醫科大學附屬北京朝陽醫院部分手術標本及病理科存檔標本，其中PCa 46例，前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)15例，正常前列腺組織(normal prostate，NP)10例。標本來自前列腺癌根治術、前列腺穿刺活檢、前列腺摘除術、前列腺膀胱全切術及意外死亡者，均經病理科醫師病理診斷證實。依照Gleason評分標準，46例PCa中包括高分化癌(Gleason評分2～4分)9例，中分化癌(Gleason評分5～7分)21例，低分化癌(Gleason8評分～10分)16例[4]。前列腺癌轉移(包括淋巴結轉移和骨轉移)患者12例，無轉移患者34例。免疫組織化學及Western blotting法所用抗體為CXCR4及pNDRG1單克隆抗體，購自美國BD及Cell Signaling公司。

1.2檢測方法

1.2.1免疫組織化學檢測CXCR4在前列腺癌組織中的表達

采用免疫組織化學法，按照試劑盒說明書逐步操作，在組織切片中加入一抗(CXCR4單克隆抗體)和二抗后，聯苯二胺(DAB)顯色，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。結果判定：蛋白表達強度根據陽性物質著色深淺及陽性細胞的百分比分為4級，高倍視野(200×)下計數，(-)為陽性細胞數<5%；(+)為陽性細胞數5%～25%，染色較淺；(++)為陽性細胞數26%～50%，棕黃色；(+++)為陽性細胞數>50%，染色較深。

1.2.2免疫印跡(Western blotting)法檢測細胞中CXCR4及pNDRG1的蛋白表達

正常前列腺上皮細胞系PrEC(Clonetics公司，美國)培養于培養基PrEGM中，人前列腺癌細胞系LNCap、PC3、DU145分別培養于含10%(體積分數)胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640 及DMEM培養基中，所有細胞均在飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下培養。收集細胞后，提取總蛋白，分別取40 μg上樣，按常規方法行Western blotting法檢測各組細胞CXCR4及pNDRG1的蛋白表達，ECL發光法顯色。

1.3統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析。計數資料用頻數和百分數表示，組間比較使用χ2檢驗，等級資料用頻數表示，多組間比較用Kruskal-Wallis檢驗，兩組間比較用Mann-Whitney檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

免疫組織化學染色顯示，46例前列腺癌組織中，CXCR4蛋白表達陽性者有30例，陽性表達率為65.2%，明顯高于前列腺增生組織(陽性表達率僅為13.3%)，差異有統計學意義(χ2=12.210，P=0.000)。12例腫瘤轉移患者中有11例陽性表達，陽性率明顯高于非轉移患者。顯微鏡下，CXCR4蛋白表達表現為陽性著色主要位于前列腺癌細胞的胞質及細胞膜上，呈淡黃色至棕黃色(圖1)。而10例正常前列腺組織中僅1例可見弱陽性表達，與前列腺癌組織中的陽性表達的差異有統計學意義(χ2=8.023，P=0.005)，但是與前列腺增生組織中的陽性表達的差異無統計學意義(P=1.000)。通過分析CXCR4蛋白表達與前列腺癌臨床病理因素的關系發現，CXCR4表達水平與前列腺癌的病理分級和Gleason評分無顯著相關性 (P=0.081)；而CXCR4蛋白表達與前列腺癌是否轉移密切相關，轉移組顯著高于非轉移組，兩組間差異有統計學意義 (P=0.002)，詳見表1。

Western blotting法檢測結果顯示在前列腺正常上皮細胞中CXCR4蛋白無明顯表達，在激素依賴性前列腺癌細胞LNCap中CXCR4表達較弱，而在惡性程度較高的去勢抵抗性前列腺癌細胞PC3及DU145中表達明顯增強，說明CXCR4可能與細胞的惡性程度明顯相關。然而，腫瘤抑制因子pNDRG1表達恰好相反，在正常前列腺PrEC細胞和低轉移潛能的LNCap細胞中表達較高，但在具有明顯轉移潛能的PC3和DU145細胞中表達缺失，說明CXCR4及pNDGR1表達水平與前列腺癌細胞的轉移密切相關(圖2)。

表1　PCa中CXCR4蛋白表達與臨床病理因素的關系

圖1　免疫組織化學檢測CXCR4蛋白在組織中的表達情況

A： Expression of CXCR4 protein was negative in NP (×200)； B： Expression of CXCR4 protein was negative in BPH (×200)； C： Expression of CXCR4 protein was positive in PCa (×200)； D： Expression of CXCR4 protein was positive in PCa (×400); CXCR4:chemokine receptor 4; BPH:benign prostatic hyperplasial NP:normal prostate.

圖2　Western blotting法檢測CXCR4及pNDRG1

CXCR4:chemokine receptor 4; NDRG1:N-myc downstream regulated gene 1.

3討論

趨化因子是細胞因子超家族成員中一大類具有化學趨化作用的分泌型小分子多肽(相對分子質量為 8～15 000)，根據N端半胱氨酸殘基(Cys)的數量及前兩個半胱氨酸空間排列不同可將趨化因子分為4類： C、CC、CXC和CX3C類。而趨化因子受體屬于7次跨膜G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCR)超家族，其N端區域與配體結合，胞內區與G蛋白偶聯，參與信號轉導[5]。最初認為趨化因子及受體結合具有激活和趨化白細胞的作用，但隨后發現它廣泛參與免疫應答、感染、細胞生長發育、分化凋亡及細胞遷移等生理病理過程，尤其在腫瘤生長、轉移中的作用越來越受到重視。目前認為參與腫瘤侵襲轉移最重要的趨化因子是CXCL12[6]，它作為配體能激活CXCR4誘導腫瘤細胞骨架重排，促使腫瘤細胞緊密黏附于血管或淋巴管內皮細胞，最終實現定向性遷移到靶組織，所以CXCL12-CXCR4生物效應軸在介導惡性腫瘤細胞靶向遷移中發揮關鍵作用，兩者均在多種腫瘤中過度表達[7]。

NDRG1是N-myc下游調節基因，相對分子質量為43 000，包含394個氨基酸，有多個潛在的磷酸化位點，碳端有3個特有的10個氨基酸串聯重復序列，可以被蛋白激酶A磷酸化。NDRG1對細胞的增生、分化、生長及應激反應等起重要作用[8]。近年來，NDRG1作為轉移抑制因子的作用和功能越來越受到關注，可能與多種腫瘤的侵襲轉移密切相關。有報道[9]，免疫組織化學證實了NDRG1蛋白在前列腺癌細胞膜中的表達顯著降低，其表達強度與腫瘤惡性程度呈負相關。

前列腺癌是老年男性常見的一種惡性腫瘤，晚期腫瘤的進展和轉移是臨床中亟待解決的關鍵問題，往往因治療失敗而導致患者死亡。本研究通過免疫組織化學檢測方法發現CXCR12受體CXCR4在前列腺癌組織中高表達，表達陽性率為65.2%，可能是前列腺癌發生侵襲轉移的機制之一，具有重要的臨床診斷價值。通過進一步分析CXCR4蛋白表達與前列腺癌臨床病理因素的關系發現，CXCR4表達水平與前列腺癌的Gleason評分并無顯著相關性，結果與相關文獻[10-13]報道一致；然而CXCR4蛋白表達與前列腺癌轉移有密切關系，轉移患者陽性表達率明顯高于非轉移患者，因此CXCR4可能是促進前列腺癌轉移的重要因素。同時，通過體外實驗證實了在高惡性和轉移潛能的前列腺癌細胞中CXCR4表達較高，而磷酸化NDRG1表達明顯減少，也說明了趨化因子受體CXCR4可能與腫瘤抑制因子NDRG1表達密切相關，共同參與了前列腺癌的進展和轉移。目前，有文獻[14-17]報道通過阻斷CXCR4，能明顯降低前列腺癌細胞的侵襲潛能，抑制前列腺癌的擴散和轉移，為治療前列腺癌的轉移提供了可能。 Liu等[13]發現，miR-182能通過下調NDRG1促進前列腺癌細胞增生，增加細胞侵襲性，促進細胞周期的G1/S轉換，說明NDRG1表達下調可能導致腫瘤的惡性表型，是調控腫瘤惡性轉化的關鍵因子。因此，CXCR4及NDRG1不僅有助于腫瘤的臨床診斷和預后判定，還有可能成為治療前列腺癌轉移的新靶點，具有廣闊的臨床應用前景。

綜上所述，CXCR4及NDRG1可能參與前列腺癌的發生、發展，尤其是對前列腺癌的轉移有重要調控作用。實驗表明前列腺癌細胞中CXCR4及NDRG1之間可能存在密切的關系，但兩者之間的相互作用機制尚待進一步的研究探索，闡明兩者之間的關系和作用機制必將對前列腺癌的診斷和治療有重要意義。

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編輯慕萌

Expression of CXCR4 and NDRG1 and its association with invasion and metastasis in prostate cancer

Ping Hao, Niu Yinong, Yang Feiya, Wang Mingshuai, Xing Nianzeng

(DepartmentofUrology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of CXCR4 and N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) in prostate cancer (PCa), and explore the relation between the protein expression and metastasis in PCa. MethodsThe expression of CXCR4 was detected by immunohistochemistry in 46 cases of PCa, 15 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH) and 10 cases of normal prostate tissues (NP). The relation between the expression and clinicopathological changes was analyzed statistically. CXCR4 and phosphorylated NDRG1 (pNDRG1) were examined by Western blotting in prostate cancer cells. ResultsThe expression level of CXCR4 in PCa was significantly higher than those in BPH and NP. The over-expression rate of CXCR4 in PCa was 65.2%. The expression of CXCR4 protein was not significantly associated with pathological grade and Gleason score (P=0.081). However, the increased expression of CXCR4 protein was significantly associated with the presence of metastasis of PCa (P=0.002). By Western blotting analysis, the expression of CXCR4 protein was stronger in PC3 and DU145 than in PrEC and LNCap cell lines. However, the expression of pNDRG1 decreased in the prostate cancer cells with high metastasis potential. ConclusionThe expressions of CXCR4 and pNDRG1 are closely related to metastasis of PCa. CXCR4 and pNDRG1 have significant clinical implications for diagnosis and treatment of PCa.

【Key words】prostate cancer; chemokine receptor 4 (CXCR4); N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1); metastasis

基金項目：首都醫科大學基礎臨床科研合作基金(16JL60)。This study was supported by Capital Medical University Foundation-Clinical Research Cooperation Fund(16JL60).

*Corresponding author， E-mail：pinghaocy@163.com

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.014]

【中圖分類號】R 737.25

(收稿日期：2016-04-06)

網絡出版時間：2016-06-0719∶01網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1901.038.html

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