遠東偏頂蛤核糖體DNA第二轉錄間隔區（ITS2）測序及分析

林杉杉+鮑相渤+劉忠穎+王超+楊慧花

摘要：利用通用引物成果擴增了遠東偏頂蛤核糖體DNA第二轉錄間隔區序列，并對其進行了一致性比對和系統進化分析，結果表明：遠東偏頂蛤ITS2序列全長共245 bp，四個個體的序列無差異。與其他物種相比，與遠東偏頂蛤一致性最高的物種為同屬的偏頂蛤，系統進化樹中，遠東偏頂蛤與同屬的其他兩個種聚為一支。本文研究結果為該種的遺傳進化及多樣性研究提供了基礎數據。

關鍵詞：遠東偏頂蛤；ITS2；系統進化

遠東偏頂蛤Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983 是廣泛分布于中日韓俄海域的大型雙殼貝類，隸屬于瓣鰓綱、貽貝目、貽貝科、偏頂蛤屬，由于其形態學特征與來自歐洲的偏頂蛤 Modiolus modiolus （Linnaeus，1758） 模式標本非常近似，致使很多人誤將遠東偏頂蛤當成偏頂蛤。2014年作者通過線粒體COI基因分析，確認大連黃海北部所得標本為遠東偏頂蛤[1]。

真核生物核糖體 DNA （rDNA） 在染色體上的排列順序為 18S、5.8S、28S rDNA，其中18S與5.8S rDNA之間存在著一個轉錄間隔區被稱為第一轉錄間隔區（ITS1），而5.8S與28S rDNA之間的間隔區被稱為第二轉錄間隔區（ITS2）。兩個轉錄間隔區與18S 、5.8S 和 28S rDNA 一起在基因組中組成多拷貝轉錄單元。其中兩個轉錄間隔區由于不加入成熟核糖體，進化過程中的選擇壓力小，進化速度較快，因而用于多種生物的進化關系構建、遺傳變異、近似種類的區分及雜交種的鑒定[2-5]。本文首次測定并報道了遠東偏頂蛤大連群體的ITS2 序列全長，并與近緣物種進行了初步比較分析，旨在為該種的系統發育、遺傳多樣性及遺傳結構研究提供基礎數據。

1材料與方法

1.1實驗材料

本文所用實驗材料于2015年8月采自遼寧省大連市付家莊海域。個體解剖后，取閉殼肌保存于95%乙醇溶液中。

1.2試驗方法

剪取適量樣本，去離子水浸泡以去除乙醇，采用TIANamp Marine animals DNA kit進行基因組DNA提取。

兩個轉錄間隔區的PCR擴增引物序列分別為ITS-2A/ITS-2B：5' –GGGTCGATGAAGAA CGCAG -3' / 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'[6]。PCR擴增體系為：TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×LA Taq Buffer II（Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mM each）8 μL，DNA模板50 ng，正反引物終濃度均為1.0 μM。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 2 min；33 個循環包括94 ℃/30 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min；最終72 ℃/5 min 延伸。擴增所得片段經瓊脂糖電泳檢測后送交上海生工行克隆測序。

從GenBank中下載貽貝科中其他物種的ITS2序列，去掉兩端5.8S及28S序列，用于比較分析，用DNAMAN計算遠東偏頂蛤與其他物種ITS2序列的一致性，以蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的ITS2序列為外群，采用PHYLIP軟件以鄰位相連法（neighbor joining） 進行系統發育樹（bootstrap=1 000）。

2結果與討論

2.1遠東偏頂蛤ITS2序列

本實驗共進行了四個個體的ITS2 PCR擴增，擴增得到的片段約500 bp（圖1），經克隆測序，去除片段兩端的5.8S及28S序列，得到長度為245 bp的ITS2全序列，四個個體擴增片段序列完全一致，堿基序列及長度無多態性（圖2）。

2.2遠東偏頂蛤與其他物種ITS2序列的比較

利用DNAMAN計算了遠東偏頂蛤與貽貝科其他物種及蝦夷扇貝ITS2序列的一致性，結果列于表1。結果顯示：貽貝科內物種ITS2長度在242-386bp之間，與遠東偏頂蛤一致性最高的物種為其同屬的的兩個物種，其中Modiolus modiolus與遠東偏頂蛤相比僅有3個堿基的缺失和3個堿基的突變。雖然貽貝Mytilus_edulis與遠東偏頂蛤同屬一科，然而其ITS2一致性小于非同科的蝦夷扇貝，可能是由于貽貝的ITS2序列過長，導致了其與遠東偏頂蛤序列一致性的嚴重降低。

ITS2在進化過程中選擇壓力較小，致使其長度及序列差異不僅存在于種間，還存在于同種的不同種群、同群體的不同個體間，甚至同一個體也存在堿基的突變[7]。喻達輝等在研究珠母貝屬 6個種的 ITS 2分子標記時曾發現同種不同個體間存在少數堿基突變現象[8]。本研究雖然尚未發現個體間ITS2堿基的差異，但由于本實驗僅以一個群體的四個樣本為材料，不能武斷地認為該種ITS序列中不存在差異。

2.3貽貝科ITS2系統進化樹的構建

在利用上述ITS2序列構建的系統進化樹中，同屬的物種基本分布于同一姊妹分支上，東方偏頂蛤與同屬的Modiolus modiolus 和Modiolus rectus聚為一支，而貽貝與同一亞科的Perna屬的兩個物種也分布在較近的分支上（圖3）。雖然個別分支置信度僅為60%，但其顯示出的進化關系與傳統的形態學分類結果保持一致。上述系統進化樹顯示了該科進化的總體趨勢：貽貝科進化分大分支，以貽貝亞科為代表的為一大分支，而另一分支則以偏頂蛤亞科代表。這一結果與Distel[9]使用18S序列研究該科進化的結果相似。

圖3基于ITS2序列構建的NJ進化樹

作者曾經利用東方偏頂蛤ITS1序列進行進化樹構建，發現無論長度還是堿基順序，不同物種ITS1均顯示出很大的差異，以此構建的進化樹與已有的分類系統大相徑庭，差異很大，而本文用ITS2序列構建的系統進化樹則與現有分類系統吻合的較好。孟學平等[10]曾經使用ITS2序列構建了蛤蜊科 3 種貝類的系統進化樹，其顯示的進化關系與使用16S序列構建的相似。綜上所述，與ITS1相比，用ITS2構建的進化樹能更好地反映近緣物種的進化關系。

參考文獻：

[1] LIU Weidong，HE Jing，BAO Xiangbo.Mitochondrial DNA Supports the Validity of Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983.Shell Discoveries [J]，2014 （3）： 18-19

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[6] Hedgecock D，Li G ，Banks M A，et al.Occurrence of the Kumamoto oyster Crassostrea sikamea in the Ariake Sea，Japan [J] .Marine Biology.1999，133（1）：65-68.

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[8] 喻達輝，朱嘉濠.珠母貝屬6個種的 ITS 2分子標記研究[J].南方水產，2005，1（4）：6-12.

[9] Distel DL.Phylogenetic Relationships among Mytilidae （Bivalvia）： 18S Rrna Data Suggest Convergence in Mytilid Body Plans [J].Molecular Phylogenetics and Evolution.2000，15（1）：25–33

[10] 孟學平，高如承，董志國，等.蛤蜊科 3 種貝類 16S rRNA 基因片段及 ITS2 核苷酸序列分析[J].湛江海洋大學學報，2006，26（4）：8-13