應用PCR-FINS技術鑒定金槍魚罐頭中金槍魚種類

安麗艷，孟鎮，仇凱*，鐘其頂，楊彤暉，郭新光

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 2(全國食品發酵標準化中心，北京，100015)

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應用PCR-FINS技術鑒定金槍魚罐頭中金槍魚種類

安麗艷1,2，孟鎮1,2，仇凱1,2*，鐘其頂1,2，楊彤暉1,2，郭新光1,2

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100015) 2(全國食品發酵標準化中心，北京，100015)

摘要為考察金槍魚罐頭中DNA降解程度以及鑒定金槍魚罐頭中金槍魚種類，文中根據魚類線粒體基因組(m tDNA)細胞色素b(cyt b)基因和12S rDNA基因，利用3對通用引物分別擴增片段大小為 358 bp(cyt b)、224 bp(12S rDNA)、123bp(cyt b)的目的片段，同時，基于123 bp線粒體cytb基因片段，通過法醫信息核苷酸測序(PCR-FINS)技術來鑒別金槍魚罐頭中金槍魚的種類，并對17個市售金槍魚罐頭樣品進行金槍魚種類鑒定。結果表明：金槍魚罐頭中DNA降解嚴重，其片段大小在100～200 bp；該研究建立的PCR-FINS技術，可以實現金槍魚罐頭中金槍魚種類的準確鑒別；17個市售金槍魚罐頭樣品中，58.8%來源于價格低廉的鰹魚，其次還包括長鰭金槍魚、青干金槍魚、扁鮀鰹、鮪魚。

關鍵詞PCR-FINS；金槍魚罐頭；種類鑒定

金槍魚類是硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形目、鯖科中金槍魚屬、狐鰹屬、舵鰹屬、鰹屬和鮪屬的統稱，多達17個金槍魚品種[1]。金槍魚罐頭因其營養美味、食用方便、貨架期長、便于攜帶等特點，深受廣大消費者的喜愛[2]。然而，金槍魚罐頭市場魚目混雜，標示不清[3]，市面上所銷售的金槍魚罐頭，大多僅標示為金槍魚罐頭，未標注所用原料的具體種屬信息。

水產加工品的原料品種鑒別已成為水產加工行業中面臨的重要問題之一。2003年，歐盟建立了魚類及其制品標簽法，明確規定魚類制品必須貼有標明商業名稱、生產方法和捕獲區域的標簽[4]。美國食品藥品管理局(FDA)列出一個可食水產品名單，規定水產品標示必須使用該名單中規定的名稱[5]。我國國家標準GB7718—2011《食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》也明確要求，食品名稱應清晰的反映食品的真實屬性[6]。

目前，國內對魚類罐頭魚源性成分鑒別尚無相關報道。本研究采用PCR-FINS方法對金槍魚罐頭食品魚源性成分進行鑒定，旨在建立高效、便捷的金槍魚罐頭中金槍魚種類的PCR-FINS鑒定方法。

1材料和方法

1.1實驗材料

金槍魚罐頭，購自當地的超市。黃鰭金槍魚生魚片作為陽性對照。

1.2主要試劑

CTAB裂解液[4% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)]；TE緩沖液(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)；Taq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp Marker，均購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖、三氯甲烷/異戊醇體積比241、無水乙醇、異丙醇。

1.3主要儀器

冷凍離心機，美國Sigma公司；T gradient PCR擴增儀，德國Biometra公司；DYY-8C型高壓電泳儀，北京六一儀器廠；CV-1000型凝膠成像系統，法國VIBER LOURMAT公司；壓力蒸汽滅菌鍋(LS-B50L)，上海醫用核子儀器廠。

1.4實驗方法

1.4.1DNA提取

取100 mg金槍魚罐頭肌肉組織樣品于2 mL離心管中，加入1 mLV(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶2∶0.8，室溫靜置過夜，5 000 r/min離心3 min，棄上清液，無菌去離子水清洗樣品，樣品組織于-40 ℃保存備用。

參考UNSELD[7]的研究，并進行適當修改。取上述組織樣品，加入1mL CTAB提取液[4% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)]，65℃溫育1～2 h，期間每隔15 min顛倒混勻1次。溫育后，離心取上清液，等體積的V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1抽提2次。加2/3體積預冷的異丙醇沉淀DNA，-20 ℃，1 h。離心棄上清液，沉淀用體積分數70%預冷的乙醇洗滌2次，干燥。沉淀用100 μL TE(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解，冰凍保存。

1.4.2基因擴增

為了考察金槍魚罐頭中DNA降解程度，以7種不同加工工藝的金槍魚罐頭為研究對象，1.4.1提取的線粒體基因組DNA為模板，參考文獻[8-9]，根據魚類線粒體基因組(mt DNA)cytb基因和12Sr DNA 基因，選取3對通用引物(見表1)進行PCR反應。

表1　通用引物序列及擴增產物大小

PCR擴增體系為25μL：10×PCR buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2μL，20 pmol/μL引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL(1.5U)，ddH2O 16.2 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性300 s，94 ℃變性30 s，相應退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，最后在72 ℃延伸300 s。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3市售樣品基因擴增

將市面上采集的17個金槍魚罐頭樣品的線粒體基因組DNA利用通用引物59-3/59-5進行PCR擴增，擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并送往華大測序公司測序。

1.4.4數據處理

運用NCBI的BLAST程序，把所有樣品的PCR產物測序結果與GeneBank數據庫中已有金槍魚線粒體cytb基因序列進行比較。

2結果與分析

2.1金槍魚罐頭DNA降解程度

由于金槍魚罐頭在加工過程中需經過高溫高壓處理，根據相關文獻報道[10-11]，DNA片段降解嚴重，為了考察金槍魚罐頭中DNA降解程度，同時保證獲取足夠數量和質量的DNA模板以適用于后續的分子生物學研究，使用表1中3對通用引物對提取的線粒體基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1，匯總結果見表2。

M-100bp Mark; 1-陽性對照(黃鰭金槍魚生魚片)；2-金槍魚罐頭(咖喱口味)；3-塊裝金槍魚(礦泉水浸罐頭)；4-油浸長鰭金槍魚罐頭；5-長鰭金槍魚(水浸)；6-金槍魚罐頭(原味)；7-金槍魚罐頭(沙拉醬味)；8-長鰭金槍魚罐頭(橄欖油浸漬)；9-空白圖1　3對通用引物(59-3/59-5、12S-F/12S-R、Cyt bL/ Cyt bH)PCR擴增結果Fig.1　PCR amplification results of three universal primers(59-3/59-5、12S-F/12S-R、Cyt bL/ Cyt bH)

提取的DNA質量用不同長度(123、224、358 bp)的目的片段來檢測。從圖1-A可以看出，所有樣品均可擴增出123 bp目的片段，并且條帶明亮清晰。從圖1-B可以看出，3、4和8號罐頭樣品可以擴增出224 bp的目的片段，1、2、5、6和7號罐頭樣品不能擴增出224 bp目的片段。從圖1-C可以看出，除陽性對照樣品外，所有的金槍魚罐頭樣品均不能擴增出358 bp的目的片段。

表2　3對通用引物PCR擴增結果匯總

注：“+”表示對應的PCR檢測結果為陽性，“-”表示對應的PCR檢測結果為陰性。

結果說明金槍魚罐頭中DNA降解嚴重，所獲得片段大小在100～200 bp，與相關文獻報道一致[10-11]。主要原因是：(1)高溫加熱引起DNA的降解；(2)輔料的添加對DNA造成一定程度的損傷，如DNA對酸堿環境十分敏感，7號罐頭樣品添加有沙拉醬，樣品處于酸性環境中，使DNA降解程度更為嚴重。此外，罐頭中某些添加劑可能會對PCR擴增造成一定的抑制作用。

2.2金槍魚罐頭樣品123 bp目的片段PCR擴增及測序結果分析

以17個金槍魚罐頭樣品的線粒體基因組DNA

為模板，利用通用引物59-3/59-5進行PCR擴增，目的片段長度為123 bp，擴增結果見圖2。所有的樣品均可擴增出清晰的條帶。將上述PCR擴增產物進行測序，測序結果在NCBI上BLAST比對，比對結果見表3。不同種類的金槍魚所占百分比見表4。

M：M-100bp Mark；1-陽性對照(黃鰭金槍魚生魚片)；2-金槍魚罐頭A；3-金槍魚罐頭B；4-金槍魚罐頭C；5-橄欖油浸金槍魚片；6-水浸金槍魚塊；7-水浸金槍魚；8-葵花籽油浸金槍魚；9-金槍魚罐頭(咖喱口味)；10-金槍魚罐頭(水浸)；11-金槍魚罐頭(植物油浸)；12-塊裝金槍魚(礦泉水浸罐頭)；13-橄欖油浸白肉金槍魚罐頭；14-金槍魚(辣味油浸罐頭)；15-油浸長鰭金槍魚罐頭；16-長鰭金槍魚(水浸)；17-植物油浸金槍魚；18-金槍魚罐頭(原味)；19-空白圖2　金槍魚罐頭樣品PCR擴增結果Fig.2　PCR amplification results of canned tuna

編號商品名Cytb序列號相似度/%鑒定結果 標稱原料2金槍魚罐頭AKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚3金槍魚罐頭BKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚4金槍魚罐頭CKF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚5橄欖油浸金槍魚片KF777796.1100Thunnustonggol(青干金槍魚)金槍魚6水浸金槍魚塊JN007677.198Thunnusalalunga(長鰭金槍魚)金槍魚7水浸金槍魚KF777811.198Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚8葵花籽油浸金槍魚AB106835.1100Auxisthazard(扁鮀鰹)金槍魚9金槍魚罐頭(咖喱口味)KM605252.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚10金槍魚罐頭(水浸)JQ434036.198Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚11金槍魚罐頭(植物油浸)—100Euthynnusaffinis(巴鰹)或Euthynnuslineatus(黑鮪)金槍魚12塊裝金槍魚(礦泉水浸)KF777796.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚13油浸白肉金槍魚罐頭KR023763.198Thunnusalalunga(長鰭金槍魚)金槍魚14金槍魚(辣味油浸罐頭)KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚15油浸長鰭金槍魚罐頭KR023763.1100Thunnusalalunga(長鰭金槍魚)長鰭金槍魚16長鰭金槍魚(水浸)KR023763.1100Thunnusalalunga(長鰭金槍魚)長鰭金槍魚17植物油浸金槍魚KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚18金槍魚罐頭(原味)KF777811.1100Katsuwonuspelamis(鰹魚)金槍魚

注：“—”：表示不能對應到具體的某一序列號。

本研究17個供試樣品中，能夠清晰的鑒定到原料物種水平的有16個樣品，10號樣品鑒定為巴鰹(E.affinis)或黑鮪(E.lineatus)。所有的樣品中，其中2個樣品能夠使消費者清晰的了解該罐頭的魚源性成分，標示到具體的種類，其他15個樣品均標示為金槍魚，對于具體的魚源性成分消費者并不清楚。

表4　通用引物FINS鑒定結果

食品法典委員會CAC(CODEX STAN 70—1981)標準規定，金槍魚屬、狐鰹屬、鰹屬和鮪屬中的14種金槍魚類均可加工成金槍魚罐頭[12]，16個樣品符合該規定，而我國國家標準GB/T24403—2009《金槍魚罐頭》中僅規定金槍魚罐頭原料為鰹魚和鮪魚類[13]，11個樣品符合該規定。8號樣品鑒定為扁鮀鰹，不符合CAC標準規定和我國《金槍魚罐頭》國家標準規定。

根據鑒定結果，所采集金槍魚罐頭樣品中有58.8%來源于價格低廉的鰹魚。這說明市場上目前所銷售的金槍魚罐頭加工原料大部分為價格低廉的鰹魚，少數來自其他金槍魚種類。基于11號樣品僅僅能夠鑒定到鮪魚屬，Genebank中關于黑鮪(E. lineatus)cytb基因序列相關信息較少，其中522 bp的黑鮪(E.lineatus)cytb基因序列與巴鰹(E.affinis)的線粒體cytb基因序列相比較，僅有3個堿基的差異，相似度高達99%，后續還需尋找其他區域cytb目標基因或線粒體其他區域(比如COI基因)的目標基因，將上述123 bp目標基因與其他目標基因結合起來進行金槍魚種類的鑒定，在一定程度上彌補單一分子標記分析的不足。

3討論

利用PCR測序法來進行物種鑒定的方法稱為FINS法[14]。FINS方法對物種進行鑒別基于核苷酸序列變異，所以選取的目標基因要有足夠的種間變異及較低的種內變異[15]。在近親緣海洋動物種屬鑒別中，線粒體DNA作為核外遺傳物質，具有分子結構簡單、嚴格的母系遺傳、無重組、快速進化、多拷貝及穩定等優點[16]，因此廣泛的用于分析進化關系。在線粒體基因內，由于不同的區域進化速率存在差異，從而使得不同區域適于分析不同的分類單位。對于遠緣物種間的分析可采用相對保守的基因序列進行比較，例如，rDNA基因相對比較保守，常用于種或科以上水平的研究[17]。對于一些親緣關系較近的物種則需要依靠進化速率相對較快的區域進行分析，例如，cytb和D-loop基因進化較快，適合種群水平差異的檢測[18]，尤其是cytb的結構和功能較為清楚，現已被廣泛地用于親緣關系和系統進化的研究。

本研究結果表明，所采集的17個市售金槍魚罐頭中，58.8%來源于價格低廉的鰹魚，其次還包括長鰭金槍魚、青干金槍魚、扁鮀鰹、鮪魚。從分類學的角度講，這幾個品種都屬于金槍魚類，在營養價值和價格上存在較大的差異，但是它們親緣關系比較近，外形和質地比較相似，特別是經過原料處理、蒸煮、殺菌等不同的加工工藝加工成罐頭后，消費者很難判斷其真實的魚源性成分。此外，在某些種類的金槍魚魚體內，組氨酸含量比其他品種金槍魚高很多，比如扁舵鰹極易腐敗，肌肉中高含量的游離組氨酸在產組胺菌的作用下容易發生脫羧反應，生成大量組胺，為扁舵鰹的食用安全帶來了隱患[19]。

本研究中采用的PCR-FINS方法能夠準確、快速的實現金槍魚罐頭中魚源性成分的鑒定，具有較強的實用性和應用價值，可為食品安監部門提供一定的借鑒和技術支持，對保護消費者合法權益、規范金槍魚罐頭市場、保障食品質量安全具有重要意義。該PCR-FINS技術的建立為我國《金槍魚罐頭》標準與國際相關標準接軌提供了技術依據，將進一步提升和規范我國的罐頭工業市場。

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Development of a method for the identification of tuna species in canned tuna by FINS

AN Li-yan1,2，MENG Zhen1,2，QIU Kai1,2*，ZHONG Qi-ding1,2，YANG Tong-hui1,2， GUO Xin-guang1,2

1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)2(National Standardization Center of Food and Fermentation, Beijing 100015, China)

ABSTRACTThis study aims to investigate the degree of DNA degradation and the species of tuna in the canned tuna products based on the analysis of fish mitochondrial genome including cytochrome b and 12S rDNA gene. A set of universal primers was used to amplify the targeted fragements with the length of 358 bp(cyt b)，224 bp(12S rDNA)，123 bp(cyt b)respectively. PCR-FINS technology was used to identify the tuna species in the canned tuna products by sequencing cytb gene of 123 bp, and 17 canned tuna products sourced from market were tested. Results showed that a very high degree of degradation in the canned tuna products for the DNA fragment sizes ranging from 100bp to 200bp. This study eastablished a accurate and reliable PCR-FINS technology with the ability to identify tuna species. Out of the 17 canned tuna samples, there were a variety of less valued species used; most popularly 58.8% of them were made from Katsuwonus, the remaining from Thunnus alalunga, Thunnus tonggol, Auxis thazard and Euthynnus.

Key wordsPCR-FINS;canned tuna;species identification

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606028

收稿日期：2015-10-16，改回日期：2015-12-07

第一作者：碩士研究生(仇凱為通訊作者)。