DNA條形碼技術檢測調理肉制品摻雜

陳健++岳巧云++邱德義

摘 要：市場上出售的調理肉制品種類繁多，質量良莠不齊，產品與標簽不符，摻假、以次充好等商業欺詐問題影響著人們的利益與健康。肉類食品摻假造假問題越來越受重視，但是由于來源肉類的形態特征已經被嚴重破壞或者肉味精等添加劑的使用，傳統的檢測方法無法快速、準確、便捷地完成此類產品成分的檢測。本研究利用DNA條形碼技術對3 個不同來源（超市、市場、火鍋店）的36 份調理肉制品進行檢測，結果表明：有27 份樣品（75%）含有雞源性成分，超市購買的調理肉制品中有2 份（10.5%）檢出配料表未標出的肉類成分。本研究證明DNA條形碼技術可作為調理肉制品的成分檢測及溯源的高效檢測方法。

關鍵詞：調理肉制品；食品摻假；DNA條形碼；快速檢測；成分鑒定

速食時代，越來越多的美味被“速凍”，且因其豐富多樣的口味、快速便捷的烹飪方法而被現代人青睞[1]。目前市場上的調理肉制品超過幾百種，加工品種主要包括：魚糜制品，如丸類和膏類；裹面制品，如裹面肉類、禽塊等；乳化肉制品，如括丸類、脆脆腸等；燒烤煙熏制品，如烤熏肉、熏腸類產品[2]。一些不法商販受到利益的驅使，用淀粉、食品添加劑，少量甚至完全不添加主料的假冒商品來欺騙消費者。這類假冒偽劣產品不僅口感不佳，更有可能給廣大消費者埋下健康隱患[3]。目前國內對于其成分的研究甚少，僅曲勤鳳等[4]利用測定15 批次魚糜制品（魚丸），發現其中11 種魚糜制品含量均<10%。但尚無對其他肉丸成分的研究報道。

對調理肉制品成分進行溯源不僅可以維護正常的經營秩序，保護消費者和生產者的安全并免受欺詐，同時也能保護一些動物物種免受過度或非法捕獵[5]。但是傳統上食品來源物種主要依靠生物的表型及解剖特征等進行鑒定。這類食品的物種的原始特征消失，這使得物種鑒別變得相對困難[6]。近年來動物源性成分檢測技術得到了快速發展，對于調理肉制品成分的鑒定，主要是從蛋白質與核酸水平進行。在蛋白質水平，常用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、液相色譜、高效液相色譜等技術進行檢測，這些方法共同的局限性在于對儀器、試劑和樣品處理要求高，且檢測加工樣品時特異性和準確性較差，費時費力[7-10]。從DNA水平進行的檢測方法包括DNA探針雜交、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[3-6]，但是也存在不足之處，需針對每種物種設計不同引物，且通用性差。

DNA條形碼技術作為一種新興的物種鑒定技術，與其他技術相比較，有著無可比擬的優勢[5]。它是一種靈敏、快速、廉價和可靠的方法，可識別和跟蹤大量的原料和加工的食品類商品（即使是深度加工的食品），以及檢測食品中的過敏原或有毒成分[6，11-12]。目前，DNA條形碼技術在漁類產品、禽畜肉類、可食用植物、加工食品鑒定中均有廣泛地應用[13-14]。它是一種應用生物本身所具有的、有足夠變異的標準化短基因片段（細胞色素氧化酶Ⅰ，（cytochrome oxidase Ⅰ，CO Ⅰ）對物種進行快速、準確鑒定的生物身份識別技術[15-17]。目前該技術在生物學各相關領域中也得到廣泛應用[18-23]。本研究嘗試通過DNA條形碼技術對市場上常見的調理肉制品的成分進行分析鑒定、溯源調查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從本地某菜市場、超市、火鍋店分別采集調理肉制品樣本36 份。

DNA提取試劑盒（目錄號DP304）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（目錄號DP210）、克隆試劑盒（目錄號VT202-02）、重組菌落鑒定試劑盒（目錄號VI102）、dNTP、Loading buffer、DNA Marker II、SYBR Green I等PCR試劑 天根生化科技（北京）有限公司；Ex-Taq DNA聚合酶 廣州瑞真生物技術有限公司；引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設備

ThermoPico 17微量臺式離心機 美國Thermo Fisher公司；DYY-6C雙穩定時電泳儀 北京科學深藍科技有限公司；Veriti 96 ABIApplied Biosystems梯度PCR儀 美國Applied Biosystems公司；MD-02N-220 Major Science金屬浴 美國Major Science公司；Alliance 4.7 UVITEC凝膠成像儀 英國Uvitec公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

剪切、稱取待測樣品25 g，用去離子水將其表面洗凈晾干后，用研磨棒將其研磨至粉末。取一小部分（約30 mg）置于1.5 mL離心管中，按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書指導提取基因組DNA。

1.3.2 DNA的擴增[24]

1.3.2.1 引物

PCR擴增所用引物為：

LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3；

HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。

1.3.2.2 擴增條件與反應體系

參考廖俊蕾等[25]的方法。

Ex-Taq DNA聚合酶擴增條件：94 ℃變性5 min；94 ℃、30 s；50 ℃、30 s；72 ℃、1 min；30 個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR反應體系（50 μL）：10 倍PCR緩沖液5 μL；正向引物（20 nmol/μL）2 μL；反向引物（20 nmol/μL）2 μL；dNTP（10 μmol/μL）2 μL；Ex-Taq（5 U/μL）1 μL；模板DNA（50 ng/μL）3 μL；無菌水定容到50 μL。

1.3.3 DNA純化

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照試劑盒說明書對PCR產物進行純化。

1.3.4 克隆

采用pGM-T連接試劑盒，按照試劑盒使用手冊對純化的PCR產物進行連接和轉化，隨機挑取白色菌落進行PCR檢測，以確定克隆陽性。

1.3.5 測序和分析

每個樣品隨機挑選12 個陽性菌株送交上海立菲生物科技有限公司測序。測序結果進行蛋白質翻譯校對無誤后，在GenBank和BOLD中進行比對和相似度分析，并記錄數據。

2 結果與分析

2.1 DNA條形碼數據的獲得及分析

3 個不同來源（超市、市場、火鍋店）的36 份調理肉制品的DNA條形碼（CO Ⅰ基因片段）片段PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1～3所示。

N. 陰性對照；B. 空白對照；1～12. 檢測樣品；M. MarkerⅡ。

N. 陰性對照；B. 空白對照；1～19. 檢測樣品；M. MarkerⅡ 。

N. 陰性對照；B. 空白對照；1～5. 檢測樣品；M. MarkerⅡ。

由表1～3可知，所有樣本的擴增產物均檢測到1 條約658 bp的擴增片段，未見非特異性擴增產物。

將PCR產物經割膠純化回收后進行連接和轉化，隨機挑取白色菌落進行PCR檢測，檢測結果如圖4所示。

B. 空白對照；1～12. 單克隆菌落；M. MarkerⅡ。

由圖4可知，挑選的12 個白色菌落均擴增出目的條帶，證明目的條帶準確轉化入大腸桿菌內，挑選這12 個陽性菌株擴大培養后送測序。

以品牌B的墨魚丸的CO Ⅰ基因擴增序列為例，DNA測序結果經Mega 6.0軟件驗證圖譜為有效序列，去掉兩端的引物得到全長有效序列為658 bp。序列在GenBank和BOLD中進行比對，結果顯示，克隆后測出的序列與GenBank中公布的原雞（登錄號：gb|KF954727.1|）全線粒體序列中的細胞色素氧化酶亞基Ⅰ相似性為99.85%，僅有一對堿基差異。

由圖6可知，在BOLD中比對的結果為100%的原雞，從而可確定這段DNA條形碼序列為原雞的序列。

2.2 某菜市場購買的調理肉制品成分鑒定

由表1可知，在某菜市場購買的12 種調理肉制品中共檢測出6 種不同的成分，其中9 種（除魚丸、魚腸、墨魚丸外）的成分僅為原雞（Gallus gallus），并未檢測出該名稱食品相符的肉類成分。如：牛肉丸僅含有原雞（Gallus gallus），但沒有檢測到牛源性成分。另外3 種魚肉類調理肉制品——魚腸、墨魚丸、魚丸的成分較為正常，除有雞源性成分外還含有魚肉成分。但是菜市場均為散裝售賣方式，無法查其配料成分，從而無法確認鑒定結果與配料是否有出入。

2.3 某超市購買的調理肉制品成分鑒定

由表2可知，在某超市購買的19 種8 個品牌的調理肉制品中，總共檢測出6 種不同的成分，其中品牌A的5 種產品（經典墨魚丸、墨魚膠外）、品牌C的香菇貢丸、品牌E的親親腸、品牌G的經典撒尿牛肉丸共8 份樣品僅檢測出原雞（Gallus gallus）成分，而這8 份樣品的配料表中標示其他成分均未檢出。品牌A的經典墨魚丸和品牌B墨魚丸產品的配料表標示含有墨魚和魚糜，但鑒定的成分分別為原雞、魷魚（Dosidicus gigas）和原雞、鰱魚，可以肯定的是這2 個樣品存在使用雞肉摻假的行為。從該結果中可以看出，不管是菜市場低價出售的還是大品牌的調理肉制品，都存在使用雞肉作為添加肉源的行為，對于雞肉過敏癥或有禁忌的人應避免進食該類食品。

2.4 某火鍋店肉制食品成分鑒定

由表3可知，在某火鍋店食用的肉制食品有5 種產品（3 種切片肉、2 種肉丸），共檢測出3種不同的成分，其中雞肉、肥牛、肥羊、牛肉丸名副其實，均檢測出相應的成分。但是羊肉丸檢測出的成分較復雜，含有原雞（Gallus gallus）、家牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）3 種成分，不排除有摻假的可能。

3 討 論

調理肉制品因其原料高度破碎化，且添加諸多食品添加劑，傳統的形態學方法已無法完成成分的鑒定[6]。

本研究使用DNA條形碼技術對3 類不同來源的36 份樣品進行了檢測，有27 份樣品（75%）含有雞源性成分，說明大部分廠家使用廉價雞肉作為其他肉類的替代品，但大部分食品并沒有進行顯著的標示。因菜市場和火鍋店的肉質食品為散裝，無法查看配料表，實驗僅能從成分與名稱的對應關系來判斷。具體情況分析如下：

1）某菜市場購買的散裝調理肉制品質量最差，11 份樣品（91.7%）中檢測出雞源性成分，9 個樣品（75%）的檢測出的成分與名稱不相符。2）某火鍋店提供的調理肉制品質量最好，采集的5 份樣品檢測出的成分均與名稱相符，僅羊肉丸的成分較復雜，除了應有的羊肉成分外，還有雞、牛源性成分，不排除有摻假的可能。3）某超市的調理肉制品鑒定后對照配料表，發現8 個樣品（42.1%）檢測的成分中僅含有雞源性成分，卻無配料表標示的其他成分，2 個樣品（10.5%）中含有配料表中未標出的成分。

從本研究的結論中可以看出，目前市場上出售的調理肉制品質量參差不齊，尤其是利用價格低廉的雞肉添加至其他種類的調理肉制品的現象較為嚴重。曲勤鳳等[4]利用實時熒光定量PCR法對市場上隨機購買的15 批次魚糜制品（魚丸）進行檢測，發現其中4 批次產品含量>

10%，其他11 種魚糜制品含量均<10%，與本研究結論相似，但其并未檢測出其他成分。本研究成功地運用DNA條形碼技術對調理肉制品的成分進行了定性檢測，為檢測調理肉制品類食品成分提供了新方法，且該方法靈敏、快速、廉價和可靠。對于維護廣大消費者合法權益，穩定市場秩序，保障食品安全具有重要的意義。

DNA條形碼技術是從分子水平上對食品進行鑒定，彌補了傳統鑒定方法的不足，其準確、高效、簡單的特點為食品鑒定領域帶來了新的革命[6]。但是DNA條形碼鑒定技術只能定性的對食品成分進行檢測，不能檢測出每種成分的含量。因此，還需與熒光定量PCR等檢測技術相結合進行進一步探索。

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