卒中后認知障礙小鼠膽堿能神經環路組蛋白乙酰化內穩態失衡的機制研究

王鑫，孫彩花，徐旸，朱小云，陳霞，施偉，楊敏

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卒中后認知障礙小鼠膽堿能神經環路組蛋白乙酰化內穩態失衡的機制研究

王鑫，孫彩花，徐旸，朱小云，陳霞，施偉，楊敏

［摘要］目的觀察卒中后認知障礙小鼠膽堿能神經環路組蛋白乙酰化內穩態變化。方法選用清潔級ICR雄性小鼠分為假手術組（n=60）和卒中后認知障礙組（PSCI組，n=60）。采用線栓法制備大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。水迷宮測試檢測小鼠認知功能；分子生物學等方法檢測小鼠梗死對側膽堿能神經環路功能和組蛋白乙酰化內穩態變化情況。結果與假手術組相比，PSCI組水迷宮成績下降（t＞29.412，P＜0.05）；中樞膽堿能神經環路中，乙酰膽堿（ACh）的含量降低（t＞26.227，P＜0.05），膽堿乙酰基轉移酶（ChAT）mRNA和蛋白的表達降低（t＞28.593，P＜0.05），乙酰化組蛋白H3（Ac-H3）水平降低（t＞24.126，P＜0.05），磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（p-CREB）和CREB結合蛋白（CBP）表達降低（t＞25.634，P＜0.05），ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化水平下降（t＞24.704，P＜0.05）。結論短暫性MCAO模型可以引起小鼠認知功能障礙。PSCI小鼠中樞膽堿能神經環路的膽堿能系統功能受損，乙酰化內穩態失衡，ChAT基因啟動子組蛋白乙酰化程度下降；這些很可能與腦卒中導致環路中相應腦區中p-CREB和CBP表達降低有關。

［關鍵詞］卒中后認知障礙；膽堿能環路；乙酰膽堿；組蛋白乙酰化；cAMP反應元件結合蛋白；小鼠

［本文著錄格式］王鑫，孫彩花，徐旸，等.卒中后認知障礙小鼠膽堿能神經環路組蛋白乙酰化內穩態失衡的機制研究［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（6）：621-628.

CITED AS：Wang X，Sun CH，Xu Y，et al.Change of histone acetylation homeostasis of central cholinergic circuits in mice with post-stroke cognitive impairment［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：621-628.

認知功能障礙是腦卒中患者最常見的并發癥之一。卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）嚴重影響患者的生活質量及功能康復，給家庭和社會帶來很大的負擔［1-2］。PSCI特指卒中后發生的認知障礙，它被認為是可以進行有效防治的認知障礙性疾病［3］。其發病機制還不完全明了，因此，探討PSCI的發病機制，尋找PSCI治療方法，具有重要的現實意義。

乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）是迄今發現的與認知功能關系最為密切的一種神經遞質，而腦內的中樞膽堿能神經環路，尤其是基底前腦-海馬通路，與認知功能關系緊密［4］。在阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）或老年性認知障礙的動物模型和臨床病例中，均發現膽堿能神經環路的重要腦區（如海馬）ACh含量下降，功能明顯受損［4-5］。近年來表觀遺傳學與認知功能的關系逐漸被人們重視，有研究發現AD患者外周血中單核細胞DNA甲基化變化與認知功能呈負相關，老年性認知障礙也與腦內相關腦區（如海馬）的染色體修飾紊亂有關［6-7］。不過，關于中樞膽堿能神經環路中表觀遺傳學變化對認知功能影響的研究卻鮮有報道。

本研究以PSCI小鼠為動物模型，觀察其中樞膽堿能神經環路中，表觀遺傳學中基因轉錄調控的重要方式之一——組蛋白乙酰化的變化情況，為更好地闡明PSCI的發生機制提供動物學研究支持，并為開發治療PSCI新的康復治療手段提供客觀依據。

1　材料和方法

1.1實驗動物

雄性ICR清潔級小鼠200只，體質量25～30g，10～12周齡，由揚州大學醫學院實驗動物中心提供。按照單雙號對小鼠進行編號，單號為模型組，雙號為假手術組。

1.2模型制作

模型組采用線栓法制備小鼠右側大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型［8］。予小鼠戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔麻醉，常規消毒，于頸部縱向切開皮膚，逐層鈍性分離、暴露右側頸總動脈，分離右側頸內動脈和頸外動脈，用動脈夾阻斷頸內動脈和頸總動脈血流，于頸外動脈遠端距離分叉處約6mm的地方斜行剪一小口（不剪斷動脈），結扎頸外動脈遠端，從動脈剪開的小口處插入6-0尼龍線栓，送至頸總動脈，然后扎緊預留好的絲線，從破口處剪斷頸外動脈，松開頸內動脈上的血管夾，將線栓從遠端向近端頸內方向推送，直至遇到輕微阻力不能再前送為止，若無明顯血液返流，估計此時置入大腦中動脈的線栓深度約1cm左右，則將頸外動脈殘端及線栓結扎，開始記錄缺血時間。缺血30min后，拔出線栓，縫合皮膚。

假手術組除不插線栓外，其余步驟相同。

在全部造模過程中，手術室溫度保持25℃左右，并在造模后使用烤燈幫助其復溫，使體溫保持在37℃左右。

1.3三苯基氯化四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride，TTC）腦染色［9］

術后24h，假手術組和模型組進行隨機編號（均為1～100號），每組選取第5、15、25、35、45號各5只小鼠，斷頭取腦，在-20℃冰箱冷凍10min待腦組織冷凍變硬后取出，用刀片去除嗅球和腦干部分，然后自額極開始行1.5mm厚連續冠狀切片，共5片。每隔2mm切一片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間；將5片腦片放入2% TTC溶液（由PBS緩沖液配制），用錫箔紙蓋住后，放入37℃溫箱孵育15～30min，每間隔5min輕柔晃動平皿，使均勻接觸到染色液。然后將TTC液倒出，在PBS液中洗3次，每次1min。最后在4%中性福爾馬林PBS溶液中固定24h。腦片中白色區域為梗死區域，紅色區域為非梗死正常組織區域。

1.4蔗糖水消耗實驗［10］

蔗糖水消耗實驗（sucrose preference test）是評價實驗動物是否有抑郁傾向的重要行為學方法之一，可有效客觀地反映實驗動物“快感缺失”的情況。其原理是利用小鼠對蔗糖水的嗜好，用以模擬人類的興趣感。于造模后第12天進行蔗糖水消耗實驗。在進行實驗前3d，予小鼠訓練飲用1%蔗糖水。在實驗時，小鼠單籠喂養，在安靜的房間內，禁食、禁水10min后，進行實驗。同時給予每只小鼠事先定量好的兩瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。30min后調換蔗糖水和純水的位置，60min后取走兩瓶并稱量。計算小鼠糖水消耗比例。

若模型組蔗糖水偏愛百分比與假手術組相比有所下降，提示該小鼠有抑郁傾向，則予以剔除，不進行水迷宮測試。

1.5水迷宮測試［11］

Morris水迷宮實驗是目前世界上被普遍認為的較為客觀的評價小鼠學習記憶的方法之一。于造模后第14天，小鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間（逃避潛伏期，escape latency）、尋找到平臺時總的游泳距離（searching distance）以及穿越原平臺次數來評價小鼠的學習記憶能力。

1.6PSCI小鼠的選取［12］

動物麻醉清醒后均出現不同程度的精神萎靡，反應遲鈍，進食減少，自潔能力下降。術后1d，假手術組小鼠精神逐漸開始恢復，反應也變得靈敏，進食增多。模型組主要表現為運動減少、不能進食、反應遲鈍等現象。3～5d后模型組小鼠精神、反應、進食逐漸恢復，1周后接近正常。模型組24h后TTC染色5只，12d后死亡10只，剩余85只；假手術組24h后TTC染色5只，12d后死亡1只，剩余94只。

在剩余模型組小鼠中，選取完全符合以下4個條件的小鼠作為PSCI小鼠。①蔗糖水消耗實驗中，蔗糖水偏愛百分比與假手術組相比無顯著性差異；②無明顯肢體癱瘓，可沿直線爬行，無繞圈爬行；③水迷宮測試中，游泳速度與假手術組相比無顯著性差異；④水迷宮測試中，逃避潛伏期和穿越原平臺次數與假手術小鼠相比有顯著性差異。

最終PSCI小鼠為70只，認知障礙率約為80%。

1.7腦組織樣品的制備［12］

PSCI小鼠選取后，隨機將兩組小鼠進行編號（假手術組1～94號，PSCI組1～70）。每組選取前60號小鼠進行后續實驗。基底前腦-海馬膽堿能神經環路是與認知關系最為密切的中樞膽堿能神經環路。小鼠斷頭取腦，選擇左側（即MCAO模型栓塞對側）的基底前腦（basal forebrain，BF）和海馬（hippocampus，HIP）作為研究對象。標記后，放入液氮中保存，以備行組織中ACh測定、實時定量熒光PCR、Western blotting和染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測。

每種檢測每組取15只小鼠。小鼠隨機編號，每組均為1至60號，ACh測定選用1、5、9……53、57號小鼠；實時熒光定量PCR測定選用2、6、10……54、58號小鼠；Western blotting測定選用3、7、11……55、59號小鼠；染色質免疫共沉淀測定選用4、8、 12……56、60號小鼠。

1.8膽堿能系統的功能相關指標的測定

1.8.1ACh含量［12］

采用ACh濃度測試試劑盒。取基底前腦和海馬的組織與組織裂解液按質量：體積=1：9混合，在冰浴中勻漿5min后，3000 r/min，4℃離心10min，取上清液，使用ACh試劑盒、酶標儀，測定組織中ACh含量。樣品操作流程如下圖。

表1　樣品操作流程

混勻，靜置10min，取200 μl于96孔板在550nm處酶標儀測定各孔OD值。組織中ACh含量的計算公式如下。

1.8.2膽堿乙酰基轉移酶mRNA水平

中樞膽堿能神經環路的活性依賴于膽堿乙酰基轉移酶（choline acetyl transferase，ChAT）、囊泡ACh轉運體、ACh酯酶和ACh受體等，這些物質分別承載著ACh的合成、轉運儲存、降解和接受功能。ChAT由于穩定性高并且僅存在于膽堿能神經元內，因此被廣泛認為是膽堿能神經元活性狀態的最佳標記物［13］。采用實時熒光定量PCR測定中樞膽堿能神經環路中ChAT mRNA水平［12］。取基底前腦和海馬組織50～100mg，加入1ml預冷TRIZOL試劑裂解組織，用玻璃勻漿器迅速充分勻漿，根據試劑盒（PROMEGA公司，SV total RNA isolation system試劑盒，編號Z3100）操作步驟，提取腦組織中總RNA，并檢測RNA的純度和完整性。選取符合要求的RNA樣品，進行Q-PCR檢測（每組至少10個樣品）。

根據美國基因生物庫提供基因核酸序列，選取G+C含量約50%的無發卡結構，相互間無同源序列的兩段特異性保守序列，用PRIMER 5.0設計引物。引物均由INVITROGEN公司合成。引物序列見表2。

表2　引物序列

根據逆轉錄試劑盒（TAKARA公司，產品編號DRR036A）操作步驟將RNA逆轉錄成cDNA，而后根據PCR擴增試劑盒（TAKARA公司，產品編號DRR041A）操作步驟進行PCR擴增反應。PCR擴增反應條件：94 45s；59℃50s；72℃35s；35個循環，20 μl反應體系；應用SDS分析軟件（APPLIED BIOSYSTEMS），以2-ΔΔCT法計算ChAT的相對表達量。1.8.3 ChAT蛋白水平

采用Western blotting方法測定神經環路中ChAT蛋白［16］。制備基底前腦和海馬組織勻漿，提取蛋白質并作蛋白定量，制膠，用Sample Buffer稀釋樣本并加熱使之變性，加樣及電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，結合一抗ChAT（一抗濃度由多次預試驗得出工作濃度，為1：1000），4℃冰箱過夜。結合二抗（1 ：5000，閉液稀釋），曝光及沖洗膠片，再將X光片結果掃入計算機，用GAPDH作為內參，一抗濃度為1：2000，二抗濃度為1：5000。用Quantity One軟件對條帶的密度進行分析，計算各條帶的平均密度值。

1.9乙酰化內穩態情況的測定

本實驗用乙酰化組蛋白H3（acetylated histone H3，Ac-H3）蛋白表達情況，來判斷腦內組蛋白乙酰化內穩態情況。采用Western blotting方法測定神經環路中Ac-H3蛋白。具體步驟同ChAT蛋白測定，Ac-H3的一抗濃度為1：500，H3的一抗濃度為1：1000。

1.10CREB結合蛋白（CBP）和p-CREB蛋白的測定

采用Western blotting方法測定神經環路中CBP和磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein，p-CREB）水平。具體步驟同ChAT蛋白測定，兩者的一抗濃度均為1：1000。

1.11ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度的測定

利用CHIP（MERCK MILLIPORE公司，產品編號：17-20000）來測定中樞膽堿能神經環路中ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度的改變。于冰凍切片上選取約2mm3基底前腦和海馬組織，經組織處理液（tissue stabilizing solution）處理后，組織中DNA經甲醛交聯，而后由超聲波打斷為200～1000 bp大小的片段；加入Ac-H3一抗（1：1000，MERCK MILLIPORE）或者陰性對照IgG抗體，旋轉，4℃冰箱過夜。第2天，蛋白和DNA交聯復合物經過多重洗脫后，進行實時定量熒光PCR擴增。PCR擴增反應條件：94℃20s、59℃30s、72℃30s，共40個循環，20 μl反應體系；PCR擴增引物序列是根據ChAT基因M型啟動子而設計，引物序列為如下［17］。上游：5'-CTG TGA GGA AGA GAG GCA GG-3'；下游：5'-GAC TGA CTG CAA GCAAAC CA-3'。取PCR產物10 μl，經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。結果經紫外凝膠成像系統檢測，以條帶像素灰度值為結果進行比較。

1.12統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析。采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1TTC染色

與假手術組小鼠相比，PSCI組小鼠在MCAO造模后24h，右側皮質、海馬和皮質下等腦區均發生不同程度的梗死（白色箭頭所指區域），5只小鼠均有梗死區域，梗死區域和部位大致相同，提示大腦中動脈線栓法可使小鼠發生缺血性卒中。見圖1。

2.2水迷宮測試

僅將最終選定的60只假手術組和60只PSCI組大鼠的水迷宮測試結果進行統計分析。與假手術組小鼠相比，PSCI組尋找到平臺時總的游泳距離增加（P＜0.05），逃避潛伏期延長（P＜0.05）。見表3。

表3　兩組小鼠水迷宮測試成績比較

2.3膽堿能系統的功能測定結果

2.3.1ACh含量

與假手術組相比，PSCI組小鼠無論是基底前腦，還是海馬，ACh含量均下降（P＜0.05）。見表4、表5。

2.3.2ChAT mRNA表達

與假手術小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦ChAT mRNA表達下降（P＜0.05），海馬ChAT mRNA表達明顯下降（P＜0.01）。見表4、表5。

2.3.3ChAT蛋白表達

與假手術組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦ChAT蛋白表達下降（P＜0.05），海馬ChAT蛋白表達明顯下降（P＜0.01）。見圖2、表4、表5。

圖2　兩組ChAT蛋白的Western blotting

表4　兩組小鼠基底前腦膽堿能系統的功能比較

表5　兩組小鼠海馬膽堿能系統的功能比較

2.4Ac-H3蛋白表達

與假手術組相比，PSCI組小鼠基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白表達均下降（P＜0.05）。見圖3、表6。

圖3　兩組Ac-H3蛋白的Western blotting

表6　兩組小鼠基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白表達比較

2.5CBP和p-CREB蛋白表達

與假手術組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦和海馬的CBP和p-CREB蛋白表達均下降（P＜0.05），其中海馬p-CREB蛋白表達明顯下降（P＜0.01）。見圖4、表7、表8。

2.6ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度

與假手術組小鼠相比，PSCI組小鼠基底前腦的實時定量熒光PCR擴增的條帶灰度值下降（P＜0.05），海馬的實時定量熒光PCR擴增的條帶灰度值明顯下降（P＜0.01）。見表9、圖5。

圖4　兩組CBP和p-CREB蛋白Western blotting

表7　兩組p-CREB蛋白表達比較

表8　兩組CBP蛋白表達比較

圖5　兩組ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化水平實時定量熒光PCR擴增條帶結果

表9　兩組ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度比較（灰度值）

3　討論

ACh是迄今發現的與認知功能、學習記憶關系最為密切的一種神經遞質［18-19］。腦內膽堿能神經元集中分布于基底前腦、海馬、腦干、皮層等部位，各部位神經元之間由突觸相互聯系，形成廣泛而復雜的神經回路，與工作記憶、言語、情緒、注意力調節等有關。其中，基底前腦和海馬與認知功能的關系最為密切［20］。基底前腦是指端腦和間腦腹側和內側的一些灰質結構，與其他腦區沒有十分明確的界線，其經典結構包含：內側隔核、Broca斜角帶的垂直支和水平支、腹側紋狀體蒼白球、杏仁核的延伸部、Meynert基底核和大細胞視前區等［20］。基底前腦-海馬通路是指基底前腦的膽堿能神經元發出纖維經穹窿海馬傘投射至海馬，這條通路是被認為是學習記憶的結構基礎，一旦損傷此通路可導致學習記憶障礙［13，20］。

在PSCI研究中均可發現膽堿能系統功能缺損，包括膽堿能神經元缺失，ChAT、ACh等水平降低，并出現相應的記憶和學習功能受損［3，21］。而針對膽堿能系統的藥物——膽堿能前體補充劑、膽堿酯酶抑制劑等，對PSCI有改善作用［3，21］。這些均說明中樞膽堿能系統功能與PSCI發生機制相關，但具體如何相關，還未完全闡明。

腦卒中累及基底前腦或海馬等部位可直接損傷膽堿能神經元而影響認知功能。而臨床上，腦卒中最常累及的部位是內囊、屏狀核、外囊和白質，通過阻斷膽堿能神經環路的聯系，導致膽堿能系統功能障礙［22-23］。在本研究中，我們利用MCAO模型模擬臨床腦卒中患者的情況。我們發現，MCAO可使得皮質及皮質下區域（包括海馬等部位）發生梗死，這些腦區的壞死不可逆轉，說明梗死側的中樞膽堿能系統的功能受到嚴重的不可逆損害，這一點在我們以往的研究和他人的研究均已證實［12，22］。本研究中，通過檢測PSCI的小鼠大腦梗死對側的基底前腦-海馬膽堿能神經環路的膽堿能系統的功能，發現其基底前腦和海馬的ACh含量、ChAT mRNA和蛋白表達均有不同程度的減少，提示PSCI的小鼠大腦梗死對側的基底前腦-海馬膽堿能神經環路的膽堿能系統的功能下降；同時，小鼠水迷宮成績明顯下降，認知功能受損。因此，可以推斷，當梗死導致同側中樞膽堿能環路出現不可逆損害，梗死對側中樞膽堿能環路未出現代償性的功能提高，卻反而出現功能受損，這很可能是PSCI的重要發病機制之一。由于梗死側中樞膽堿能環路相關腦區已經出現不可逆損傷，因此，PSCI康復和治療的重點目標應著眼于改善梗死對側的中樞膽堿能神經環路的功能。

近年來，神經元染色質中組蛋白乙酰化在認知功能方面的重要作用越來越受到關注。組蛋白乙酰化是表觀遺傳學中基因轉錄調控的重要方式之一，組蛋白乙酰化狀態在組蛋白乙酰基轉移酶（histone acetytransferases，HATs）和組蛋白去乙酰化基酶（histone deacetylases，HDACs）的相互拮抗作用下保持動態平衡，HATs促使組蛋白乙酰化并促進轉錄活性，反之HDACs抑制基因轉錄［24-25］。Saha等提出的組蛋白乙酰化內穩態學說表明，HATs和HDACs兩大家族相互拮抗，使細胞內的乙酰化和去乙酰化處于一種動態平衡中，精確調控基因的轉錄與表達［26］。

基底前腦-海馬膽堿能神經環路作為認知功能的關鍵環路，其基本組成單位即膽堿能神經元的染色質重塑與認知功能密切相關。本研究也發現，在PSCI的小鼠中，其中樞膽堿能神經環路相關腦區——基底前腦和海馬的Ac-H3蛋白水平顯著下降。結果提示組蛋白乙酰化內穩態已經在PSCI小鼠中的腦內被打破很可能是其認知障礙的始動因素。

為了探討PSCI小鼠腦內乙酰化內穩態失衡的原因，我們觀測了小鼠中樞膽堿能神經環路中CBP和p-CREB蛋白的變化情況。CBP具有內源性組蛋白乙酰基轉移酶活性，可增加組蛋白乙酰化程度［27］。CREB是屬于亮氨酸拉鏈家族的轉錄因子，通過與數百種基因序列的啟動子和增強子區域內的cAMP反應元件（CREs）相結合而發揮轉錄調控作用［28］。CREB經磷酸化后活性增強，招募CBP并形成CREB-CBP復合物［29］。本實驗發現CBP和p-CREB蛋白在PSCI小鼠膽堿能神經環路中均降低，與Ac-H3蛋白水平下降表現一致，說明CBP和p-CREB蛋白表達下降很可能是PSCI小鼠腦內乙酰化內穩態失衡的原因。

已有研究證實，組蛋白乙酰化可以對膽堿能神經環路產生影響［16-17］。例如，曲古霉素A（Trichostatin A，TSA）能促進組蛋白乙酰化，啟動ChAT mRNA轉錄，增強ChAT蛋白合成，并能逆轉由于DNA去甲基化導致的ChAT低表達，表明組蛋白乙酰化影響ACh的生成［16-17］。TSA誘導ChAT基因轉錄與ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度增強有關［16-17］。這是由于ChAT基因啟動子中含有cAMP反應元件結構［17］，是CREB結合位點，CBP增多后，直接結合到啟動子上，可使得ChAT基因啟動子組蛋白乙酰化程度增強、ChAT基因轉錄增加；反之，結合到啟動子上的CBP減少，ChAT基因啟動子組蛋白乙酰化程度降低，ChAT基因轉錄減少。本實驗通過CHIP也證實，PSCI小鼠中，基底前腦和海馬的ChAT基因M型啟動子組蛋白H3乙酰化程度的確較假手術組小鼠降低，提示乙酰化內穩態失衡已經對PSCI小鼠的膽堿能神經環路產生影響。

綜上所述，PSCI小鼠中樞膽堿能神經環路功能受損機制很可能是，腦卒中導致腦內p-CREB和CBP蛋白減少，膽堿能神經環路乙酰化內穩態失衡，ChAT基因M型啟動子組蛋白乙酰化程度降低，ChAT基因轉錄減少，Ach生成減少，認知功能下降。短暫性MCAO模型可以引起小鼠認知功能障礙，PSCI的小鼠中樞膽堿能神經環路的膽堿能系統功能受損，乙酰化內穩態失衡，ChAT基因啟動子組蛋白H3乙酰化程度下降，而這些很可能與腦卒中導致環路中相應腦區中p-CREB和CREB結合蛋白表達降低有關。

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Change of Histone Acetylation Homeostasis of Central Cholinergic Circuits in Mice with Post-stroke Cognitive Impairment

WANG Xin，SUN Cai-hua，XU Yang，ZHU Xiao-yun，CHEN Xia，SHI Wei，YANG Min

Department of Neurological Rehabilitation，Affiliated Wutaishan Hospital，Medical College of Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225001，China

Correspondence to WANG Xin.E-mail：wx000805qm@yeah.net

Abstract：Objective To observe the change of histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits in mice with post-stroke cognitive impairment（PSCI）.Methods The male ICR mice were divided into sham group（n=60）and PSCI group（n=60）.The middle cerebral artery occlusion（MCAO）model was established.The Morris water maze test was used to test the cognitive function，and the changes of function and the histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits of unaffected side were detected by molecular biology methods.Results Compared with the sham group，the scores of Morris water maze test decreased in PSCI group（t＞29.412，P＜0.05）；while the acetylcholine（Ach）level decreased（t＞26.227，P＜0.05），as well as the expression of choline acetyltransferase（ChAT）mRNA and protein（t＞28.593，P＜0.05），acetylated histone H3（Ac-H3）（t＞24.126，P＜0.05），phosphorylated cAMP response element-binding protein（p-CREB）and CREB binding protein（CBP）（t＞25.634，P＜0.05），and the acetylated histone level of M promoter of ChAT（t＞24.704，P＜0.05）.Conclusion Transient MCAO could cause PSCI.The function of the central cholinergic circuits was impaired，especially the histone acetylation homeostasis of the central cholinergic circuits，such as the acetylated histone level of ChAT promoter decreased.All of that might be related with the decline of p-CREB and CBP level in the corresponding brain regions induced by stroke.

Key words：post-stroke cognitive impairment；cholinergic circuits；acetylcholine；histone acetylation；cAMP response element-binding protein；mice

［中圖分類號］R749.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0621-08

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.001

基金項目：國家自然科學基金項目（No.81301673）。

作者單位：揚州大學醫學院附屬江蘇省揚州五臺山醫院神經康復科，江蘇揚州市225001。

作者簡介：王鑫（1978-），男，漢族，江蘇揚州市人，博士，副主任醫師，主要研究方向：神經康復基礎和臨床研究。E-mail：wx000805qm@yeah.net。

收稿日期：（2016-03-11修回日期：2016-05-25）