小鼠動脈粥樣硬化發展不同階段巨噬細胞表型變化研究*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)　龔　敏　卓小禎　馬愛群

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小鼠動脈粥樣硬化發展不同階段巨噬細胞表型變化研究*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)龔敏△卓小禎馬愛群▲

摘要目的：探討動脈粥樣硬化的形成(脂質條紋)和發展(進展的復合斑塊)不同階段巨噬細胞不同表型(Phenotype)的變化及表達。方法：將SD小鼠20只喂以高脂飲食，每隔2周分別處死10只，取全部主動脈觀察斑塊的組織形態學變化和斑塊的穩定性，以了解動脈粥樣硬化的發生、發展過程，此外用免疫組化法(Immunochemistry)重點觀察斑塊內巨噬細胞的分型情況。 結果：①隨著動脈粥樣硬化發展，斑塊面積明顯增加。②CD4+隨著動脈粥樣硬化發展明顯增加；而CD8+無明顯變化；③巨噬細胞M1表型在動脈粥樣硬化的發展明顯增加，M2表型在不同階段變化不明顯。結論：M1/M2比例失衡，動脈粥樣硬化斑塊的發展相關。

主題詞動脈硬化/病理生理學動脈硬化/組織學巨噬細胞表型實驗，動物小鼠

動脈粥樣硬化是慢性炎癥過程， 巨噬細胞在斑塊內的堆積是其關鍵步驟。巨噬細胞為多向性細胞，替代激活(M1)和經典激活(M2)的巨噬細胞決定炎癥進展。AS的轉歸不僅取決于巨噬細胞的數量更重要的是巨噬細胞的活性狀態，因此調控M1/M2將對AS斑塊進展和穩定性產生重要影響[1]。本研究觀察動脈粥樣硬化的形成(脂質條紋)和發展(進展的復合斑塊)不同階段，巨噬細胞不同表型(Phenotype)的變化及表達。

材料與方法

1動物與試劑實驗用SD小鼠20只購自西安交通大學實驗動物中心。喂以高脂飲食，每隔2周分別處死10只，取全部主動脈觀察斑塊的組織形態學變化和斑塊的穩定性，以了解動脈粥樣硬化的發生、發展過程，此外用免疫組化法(Immunochemistry)重點觀察斑塊內巨噬細胞的分型情況。

2研究方法① 病變血管動脈粥樣斑塊定量分析：取主動脈升部、弓部及胸主動脈縱形切開，1%福爾馬林固定，油紅O染色，2.5倍光鏡下觀察照像，圖像掃描計算血管損害面積與血管總面積之比；② 粥樣斑塊穩定性分析:天狼星紅(Sirius red)染色測定膠原蛋白表達,免疫組化染色檢測CD4+和CD8+T細胞陽性細胞計數；③ 動脈粥樣硬斑塊不同發展階段中的巨噬細胞表型(Phenotype)變化：免疫組化法以CD68(標記所有的組織巨噬細胞)，CD86(標記M1)，Detectin(標記M2)為細胞標志物標記不同類型的組織巨噬細胞，CD68+CD86+細胞則為促進炎癥發展的巨噬細胞(Pro-inflammatory macrophages，M1)，而CD68+detectin+細胞為促修復的旁路激活的巨噬細胞(Alternatively activated macrophages, M2)。

結果

1兩組動脈斑塊面積變化兩周組陽性區域出現脂質條紋及少量脂質斑塊，斑塊面積為(10.10±1.57)%，4周組斑塊面積為(19.08±2.35)%，4周組較兩周組動脈斑塊面積明顯增加(P<0.05)。

2動脈粥樣硬化不同階段炎性細胞的變化見表1。4周組CD4+較兩周組明顯增加(P<0.05)；4周組CD8+較兩周組無明顯變化(P>0.05)；但4周組與兩周組之間CD4+/CD8+比值明顯增加(P<0.05)。

表1　動脈粥樣硬化不同階段炎性細胞的變化±s)

注：兩組相比，P<0.05

3斑塊不同發展階段巨噬細胞表型變化見表2。CD68在兩組之間無明顯變化(P>0.05)； 4周組CD68+CD86+為(7.06±1.77)% ， 較兩周組明顯增加(P<0.05)；4周組CD68+detectin+為(19.51 ±1.15)%，較兩周組明顯減少(P<0.05)。

表2　斑塊不同發展階段巨噬細胞表型變化±s)

注：兩組相比，P<0.05

討論

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是動脈壁的慢性炎癥過程，巨噬細胞在斑塊內的堆積，發揮促炎效應是其關鍵步驟。然而巨噬細胞是一種多向性細胞，不同活性的巨噬細胞對炎癥損傷具有不同的作用，替代激活的巨噬細胞(Alternatively activated macrophages, M2reparative macrophages)促進炎癥損傷的修復，而經典激活的巨噬細胞(Classically activated macrophages, M1destructive macrophages)則加重炎癥損傷[1]。在炎癥模型中，損傷性和修復性的巨噬細胞的比例總處于動態平衡，而疾病的轉歸不僅取決于巨噬細胞的數量更重要的是巨噬細胞的活性狀態[2,3]。

新近發現：肥胖小鼠脂肪組織中的巨噬細胞主要是M1細胞，表現為促炎活性，介導胰島素抵抗和代謝綜合征；而體瘦小鼠脂肪組織中的巨噬細胞主要是M2細胞，表現為抗炎活性，抑制糖耐量減低[3]。既往研究發現在人頸動脈粥樣斑塊存在著M1/M2比例失衡，并與斑塊的穩定性呈強相關，主要表現為M1活性過強，而M2活性低下[4]。

巨噬細胞是與動脈粥樣硬化相關的炎癥細胞。早在1815年發現：AS病變部位存在巨噬細胞。1979年ERRITY證實：在豬的AS斑塊中存在大量巨噬細胞，巨噬細胞通過黏附浸潤血管內皮細胞并形成泡沫細胞從而促進AS的發展。巨噬細胞被認為是AS發生和發展的“關鍵動力”[5]。在體內外不同的局部微環境影響下巨噬細胞可分化為M1型(經典活化型)或M2型(替代活化型)巨噬細胞。M1型和M2型巨噬細胞均存在于AS斑塊內,但發揮的作用卻不同。在LPS及INF-r的誘導下巨噬細胞可分化為M1型,同時分泌大量的LI-12、IL-23、IL-6及INF-a等炎性細胞因子,參與炎癥反應、病原菌的清除以及活性氧的表達，促進AS的發展。在IL-4、IL-13 、IL-1或者維生素D3的誘導下巨噬細胞可分化為M2,IL-10、精氨酸酶、清道夫受體、甘露糖受體的分泌及表達增加，抑制炎癥反應，促進組織損傷修復[6]。

根據是否表達CD4或者CD8分子將淋巴細胞分為CD4+和CD8+T細胞。兩種細胞功能不同，CD4+細胞識別13～15個殘基組成的外源性抗原肽，受自身MHCII類分子的限制,活化后形成的效應T細胞可分泌不同的細胞因子,在幫助免疫反應中其他免疫細胞發揮效應起到重要作用。CD8+T細胞識別8～12個殘基組成的內源性抗原肽，受自身MHCI類分子限制、活化后，分化為Tc細胞,具有細胞毒作用,可特異性殺傷受感染細胞或者功能失調細胞,如瘤細胞等[7]。Chan[8]在研究中證實：CD4+T細胞在巨噬細胞亞型調節過程中起主要作用，并且相對于巨噬細胞本身成分，淋巴細胞誘導產生的細胞因子環境在誘導巨噬細胞向M2亞型轉化過程中起到的作用更為關鍵。無論是在炎癥的初始階段還是維持階段，CD8+T細胞均可降低M1特征性分子如IL-6、TNF-a的表達，但對M2指標均無影響。

本研究發現：動脈粥樣硬化的形成(脂質條紋)和發展(進展的復合斑塊)不同階段，巨噬細胞不同表型(Phenotype)的變化及表達也不相同。在復合斑塊期CD4+較脂質條紋期明顯增加；而CD8+變化則不明顯。在復合斑塊期巨噬細胞M1表型較脂質條紋期明顯增強；而M2表型則略減少。M1/M2比例失衡，動脈粥樣硬化斑塊的發展相關,這和既往研究結論相似。因此，調節或控制巨噬細胞的活性狀態將對AS斑塊進展、尤其是斑塊的穩定性產生重要影響，并有可能成為一種新的潛在治療靶點。

參考文獻

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[3]Lumeng CN,Bodzin JL.Saltiel AR. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization[J].J Clin Invest,2007，117(1): 175-184.

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[7]Moser M,Leo O.Key concepts in immunology [J]. Vacine,2010,28(Suppl 3)：C2-13.

[8]Chan T,Pe K,Huth K,etal.CD4+T-cell are important in regulating macrophage polarization in C57B2/6 wildtype mice [J]. Cell Immunol,2011,266(2):180-186.

(收稿：2015-12-28)

通訊作者▲

【中圖分類號】R543.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.001

·論著·基礎研究·

*陜西省科技廳自然科學基金項目(2014JM4151)

△西安市中心醫院心內科