Axin基因對人腎母細胞瘤細胞生物學特性的影響*

西安市兒童醫院病理科(西安 710002)　陳廣生　安　魯　李　娟　張　強　惠軍朋

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·臨床病理·

Axin基因對人腎母細胞瘤細胞生物學特性的影響*

西安市兒童醫院病理科(西安 710002)陳廣生安魯李娟張強惠軍朋

摘要目的：研究Axin基因對人腎母細胞瘤細胞G401生物學特性的影響為人腎母細胞瘤的分子病理機制及治療、預后提供基礎研究依據。方法：采用基因工程的方法構建含 Axin基因的真核表達載體pIRES2-EGFP-Axin，穩定轉染G401細胞，建立高表達的G401細胞系。用MTT實驗、克隆形成能力實驗、侵襲能力實驗三種方法檢測 Axin基因對G401細胞生物學特性的影響。結果：重組載體pIRES2-EGFP-Axin經PCR和雙酶切鑒定結果顯示：在約2500 bp大小處出現一條特異性條帶，轉染G401細胞后，經Western blotting結果顯示：Axin蛋白在G401細胞中成功表達，同時，轉染了pIRES2-EGFP-Axin質粒的G401細胞生長速度顯著減慢(P<0.05)；G401細胞的克隆形成能力和侵襲力均顯著降低(P<0.05)。結論：我們成功構建了重組真核表達載體PIRES2-EGRP-Axin，且通過Western blotting 檢測篩選獲得穩定轉染的G401細胞系，最后Axin體外實驗對G401細胞生物學特性影響表明：Axin基因與腎母細胞瘤的發生發展有一定關系。

主題詞腎母細胞瘤/治療基因/治療應用細胞分裂@ Axin@ G401

在1997年對天然突變系小鼠基因分析中發現了基因Axin (Axis formation inhibition)[1]。 由于Axin能夠下調β-catneni的水平而被視為一種腫瘤抑制因子[2]。 后來人們發現了與Axin同源的蛋白，為Conductin(又稱Axi l和Axin 2)，與Axin有著相似的生物學功能[3]。Axin與許多人類腫瘤的發生發展有著密切的關系。腎母細胞瘤(Nephroblastoman)是嬰幼兒最多見的惡性實體瘤之一，具有較高的致死率，是導致兒童因腫瘤死亡的主要腫瘤之一 ，其發病原因目前尚不清楚，但有證據表明腎母細胞瘤的形成可能與一定的內環境改變和基因變異有關。有關Axin在腎母細胞瘤發生發展中的作用及其機制研究，在國內外尚未見相關研究。國外研究發現：在兒童腎母細胞瘤中發現有Axin1基因的缺失或突變或雜合性消失，提示Axin基因與腎母細胞瘤的發生發展有一定關系[4]。本研究擬通過初步探索Axin對人腎母細胞瘤生物學特性的影響，來探討Axin在腎母細胞瘤發生發展中的作用及分子機制，為腎母細胞瘤的生物治療提供依據。

材料與方法

1材料與試劑人腎母細胞瘤細胞株G401由西安市兒童醫院病理科提供；質粒 pIRES2-EGFP 、真核轉染試劑Lipofectamine 2000由Invitrogen公司提供； NheI、 SalI購于TaKaRa公司； PCR引物由上海生工合成；其余試劑均由西安晶彩生物科技有限公司提供。

2實驗方法

2.1PCR引物設計和真核表達載體的構建：根據GenBank公布的小鼠Axin基因的序列，設計全長引物，P1(上引): 5′-GCGGCTAGCAT GCAGAGTCCCAAAATGAAT-3′含有NheI的酶切位點(劃線部分)和啟始密碼；引物 P2(下引): 5′-GCAGTCGACTCAGTCCACCTTTTCCACCTT-3′含有SalI的酶切位點(劃線部分)及終止密碼子。以pCMV5-HA-Axin質粒為模板，用P1和P2引物擴增Axin基因的全長，將基因Axin純化的PCR產物經NheI和SalI酶切，克隆至pIRES2-EGFP質粒，轉化大腸桿菌DH5α，卡那霉素平板篩選陽性克隆，命名為pIRES2-EGFP-Axin。小量提取陽性克隆菌質粒，以NheI與SalI酶切鑒定，測序由上海生工完成。

2.2真核載體pIRES2-EGFP-Axin轉染高表達的G401細胞并篩選穩定的細胞系：細胞用RPMI 1640培養基(含10%小牛血清)在37℃、5% CO2濃度條件下培養。轉染前24 h將處于對數生長期的細胞重新接種于6孔板(瞬時)和24孔板(穩定)中，貼壁細胞在長滿底面積80%時進行轉染。轉染按照LipofectamineTM2000試劑說明書操作。于轉染后48 h收集6孔板內細胞，作為瞬時轉染細胞表型鑒定用。于轉染后72 h按1∶10比例傳代于60 mm直徑培養皿中，然后加入適量(400～2000 μg/ml)G418進行篩選，兩周后挑取單個細胞集落，擴大培養，然后作為穩定轉染細胞表型鑒定用。

2.3Western blotting鑒定：Axin蛋白在G401細胞中的表達：蛋白提取RIPA裂解液試劑盒購于西安晶彩生物科技有限公司, 采用BCA法測定樣品蛋白質的濃度，確定相同上樣量所需體積數。SDS-PAGE及Westren blotting：采用SDS-PAGE不連續系統進行電泳.電泳結束后將與凝膠電泳大小一致的6張濾紙和1張PVDF膜浸入轉移緩沖液中5～10 min，凝膠置負極，PVDF膜正極，濾紙覆蓋，排除氣泡。濕轉法恒壓為80V轉印約1.5 h，轉膜結束膜用立春紅染色，標記蛋白Marker條帶。膜于TBS中漂洗15 min，脫脂奶粉37℃封閉2 h。封閉結束后加入一抗，4℃過夜。TBST洗滌三次后加入相應HRP標記二抗室溫作用1 h，TBST充分洗滌后ECL化學發光系統顯色，壓片，曝光，顯影，定影后晾干保存。

2.4噻唑藍(MTT)比色法繪制細胞生長曲線：用0.25%胰蛋白酶消化轉染含Axin表達質粒細胞以及轉染空質粒細胞，按每孔600個細胞接種于96 孔培養板，37℃、5% CO2孵箱中孵育，每天取出一96孔板加MTT溶液(5 mg/ml)20μl，37℃，孵育4 h后，棄上清，每孔加入150μl DMSO，震蕩10 min， 使結晶物充分溶解；測定490 nm 處測OD值，繪制細胞生長曲線。

2.5克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力：0.25%胰蛋白酶消化轉染含Axin表達質粒細胞以及轉染空質粒細胞，制備細胞懸液，按每孔100個細胞接種于六孔板中。37℃、5% CO2孵箱中靜止培養2～3周，克隆形成后用Giemsa染色30 min ，計數直徑>1mm 的克隆細胞數目。

2.6侵襲試驗測試G401細胞的侵襲能力：將購于BD公司的人工基質膠Matrigel按每孔40 μl加入Transwell小室的聚碳酸酯膜(微孔濾膜孔徑為8 μm)的上室面，在4℃進行風干，將細胞分為3組，無血清饑餓24 h后，胰酶消化，終止消化且離心后棄去培養基，PBS漂洗2遍，用無血清RPMI-1640培養基重懸細胞沉淀，稀釋至密度為106/ml，取100 μl細胞液加入Transwell上室中，在下室中加入含10%血清培養基500 μl，24 h后，甲醇固定20 min，0.1%結晶紫染色15～20 min，輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將上室取出，從聚碳酸酯膜內側面用吸水紙吸干水分，自然干燥， 測定前，將各實驗組上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6 ml 33%醋酸脫色，充分震蕩，每組設定5 復孔；同時設置調零孔(33%醋酸)；比色：每孔取脫色液150 μl 加入96 孔板中，在570 nm 處測定OD 值。

結果

1pIRES2-EGFP-Axin真核表達載體的構建核酸電泳結果顯示： Axin基因成功克隆至載體pIRES2-EGFP中，約在2500 bp處出現了一條特異性條帶。重組質粒的PCR和雙酶切鑒定如圖1所示。

2Axin蛋白在人腎母細胞瘤細胞中的表達鑒定取轉染72 h后的穩定轉染細胞表型用Western blotting法進行鑒定Axin蛋白的表達。檢測結果顯示：正常的G401細胞和轉染了空載質粒的G401細胞中均未檢測到Axin蛋白的表達，只有轉染了pIRES2-EGFP-Axin質粒的G401細胞中檢測到了特異性的Axin蛋白條帶(如圖2所示)。

圖1重組質粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR和雙酶切鑒定(M: DNA marker；1：重組質粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR擴增；2：重組質粒pIRES2-EGFP-Axin的NheI與SalI雙酶切)

圖2β-actin在G401中的表達和Axin在G401中的表達的Western blotting(1、2：正常的G401細胞；3、4：轉染空載質粒的G401細胞；5、6：轉染質粒pIRES2-EGFP-Axin的G401細胞)

3MTT法繪制G401細胞的生長曲線來觀察細胞的生長增殖能力見圖3。①正常培養的人G401細胞；②轉染pIRES2-EGFP質粒的G401細胞；③轉染pIRES2-EGFP-Axin質粒的G401細胞。實驗結果顯示：Axin的表達使G401細胞的生長減慢，明顯受到抑制，與①組和②組對照細胞組之間有顯著性差異 (P<0.05)；而①組與②組之間無顯著性差異 (P>0.05)。

4克隆形成能力實驗結果見圖4。對照組的細胞克隆數分別為：332 ± 9.8；331 ± 10.1，而轉染了pIRES2-EGFP-Axin質粒的G401細胞克隆數顯著減少為215± 9.6，與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。

5G401細胞侵襲試驗見圖5。以穿過Matrigel膠的細胞數來表示瘤細胞的侵襲力，本實驗中采用測OD值的方法來間接的反應G401細胞的侵襲力。細胞的侵襲試驗結果顯示：對照組的細胞侵襲力分別為0.9896± 0.01；0.9798± 0.05。而轉染了pIRES2-EGFP-Axin實驗組的侵襲力顯著降低到0.4783± 0.11(P<0.05)。

圖3　不同實驗組下細胞的生長曲線

圖4　不同實驗組下細胞的克隆形成能力

圖5　不同實驗組下細胞的侵襲能力

討論

腎母細胞瘤是兒童發病率最高的惡性腫瘤[5]。有APC或PTCH(patched)基因突變的病人患病率較高[6]。最近在腎母細胞瘤中發現有Axin1基因的缺失或突變或雜合性消失，這些突變主要位于C末端第6～10個外顯子處[7]。Axin自身二聚體的形成對抑制TCF的轉錄活性有很大影響[8]，在有APC、β-catenin 或Axin1突變的HCC或結腸癌細胞中野生型Axin1的表達可誘導細胞凋亡。在腫瘤中檢測到Axin基因的缺陷以及腺病毒轉染野生型Axin到Axin突變的癌細胞和APC突變的癌細胞，導致β-catenin的降解及細胞凋亡[9]，這些都進一步說明Axin是腫瘤抑制因子。通過導入野生型Axin或者APC可能成為治療這些癌癥的一種手段[10]。

本實驗初步探索Axin基因對人腎母細胞瘤G401細胞生物學特性的影響。成功構建含有Axin基因的真核表達載體，Western blotting鑒定結果顯示：Axin基因在G401細胞中成功表達。Axin基因對人腎母細胞瘤生物學影響的結果顯示：轉染pIRES2-EGFP-Axin質粒的G401細胞的增殖和生長，受到明顯抑制，細胞的生長速度顯著減慢；克隆形成能力實驗表明：Axin蛋白在G401細胞中的表達影響其增殖能力，其克隆形成能力顯著降低；G401細胞侵襲能力實驗表明：轉染含有Axin基因的質粒的G401細胞的侵襲能力顯著低于對照組的G401細胞的侵襲能力。上述實驗結果表明：Axin基因可抑制G401細胞的增殖、克隆形成能力和侵襲能力。提示：Axin可能會成為人腎母細胞瘤基因治療的有效靶點。

參考文獻

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[10]Brauburger K, Akyildiz S, Ruppert JG,etal. Adenomatous polyposis coli (APC) membrane recruitment 3, a member of the APC membrane recruitment family of APC-binding proteins, is a positive regulator of Wnt-β-catenin signaling[J]. FEBS J，2014，281(3):787-801.

(收稿：2015-12-01)

【中圖分類號】R737.11

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.049

Biological effects of Axin gene on human Wilms' tumor cells

Department of Pathology, Xi，an Children，s Hospital (Xi，an 710002)Chen GuangshengAn LuLi Juanet al

ABSTRACTObjective： Research effects of biological characteristics of Axin gene on human Wilms tumor cell G401 to molecular pathogenesis, treatment and prognosis of Wilms tumor provide basic research basis. Methods：Constructed eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-Axin by genetic engineering methods, transfected stably G401 cell, establishing of G401 cell lines of high expression, By MTT assay, colony forming ability experiments and invasion experiment three methods detect effects of biological characteristics of Axin gene in G401 cell. Results：Recombinant vector pIRES2-EGFP-Axin by PCR and double digestion results showed that about 2500 bp appeared in a specific band, after transfected G401 cell, Western blotting results showed: Axin protein successfully expressed in G401 cell. Meanwhile MTT assay in vitro experiments showed that: transfected pIRES2-EGFP-Axin G401 cell growth slowed significantly(P<0.05), Colony formation and invasion experiment results also show: after transfected plasmid pIRES2-EGFP-Axin the G401 cell colony formation and invasion were significantly reduced(P<0.05).Conclusion：We successfully constructed the recombinant eukaryotic expression vector PIRES2-EGRP-Axin, and screened stably transfected cell lines through Western blotting analysis, the last Axin in vitro effects on the biological characteristics of G401 shows: a certain relationship between Axin gene with the occurrence and development of Wilms' tumor.

KEY WORDSNephroblastoma/therapyGene/therapeutic useCell division@Axin@G401

*陜西省自然科學基金資助(2010JM4026)