養殖場飲用水微生物檢測方法的建立

陳明非 劉威 李巍

養殖場飲用水質量直接關系到畜禽健康及生產水平。養殖場飲用水受到微生物污染會引起畜禽腸道疾病反復發作。養殖場飲用水受到微生物污染的途徑很多：淺井水和地表水易受畜禽糞便污染；供水塔、貯水池及輸水管道長期不清洗會造成微生物滋生；飲水線中殘留有藥物載體（淀粉、葡萄糖等）會成為細菌長期滋生的基質。養殖場應該定期檢測飲用水的微生物指標，為開展飲水系統的清潔與消毒工作提供依據。

人的飲用水微生物指標由專業機構檢測，依據GB/T5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法》，動物飲用水和人的飲用水微生物指標最好一致，但是養殖場飲用水易受污染，尤其是飲水線末端的水，因此養殖場飲用水微生物檢測需求多，頻繁送水到專業機構檢測既不現實又不經濟。筆者多次對養殖場飲用水進行微生物檢測，總結出一套簡便易行的檢測方法，檢測結果與GB/T5750.12-2006的標準方法有很好的一致性，適于在養殖場或基層畜牧獸醫實驗室推廣應用。

1實驗原理

1.1評價指標

評價水質清潔度有三個重要指標：菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群。總大腸菌群指自然環境中的大腸菌群，用提高培養溫度的方法可以將自然環境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分開，因此耐熱大腸菌群的檢出是水質被糞便污染的標志。

1.2指標限值

養殖場貯水池、水塔、飲水線入口三處水質的微生物學指標是：菌落總數

2實驗方法

2.1水樣采集

分別采集供水塔或蓄水池，飲水線入口，飲水線末端三處的水樣，裝入滅菌容器中。

2.2實驗器材

2.2.1儀器設備高壓蒸汽滅菌器，干熱滅菌箱，恒溫培養箱（2臺），水浴鍋，天平，菌落計數器。

2.2.2實驗耗材試管，平皿，吸管、三角燒杯、玻璃瓶等，耗材使用前要干熱滅菌。

2.3培養基

營養瓊脂，雙料乳糖蛋白胨培養液（常規乳糖蛋白胨培養液除蒸餾水外其他成份加倍），伊紅美藍培養基，這些培養基可以使用市售的成品，也可以按下面方法自制：

營養瓊脂：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000 mL，這些成分混合后，水浴加熱溶解，調整PH值為7.4-7.6，121℃高壓滅菌20 min。

雙料乳糖蛋白胨培養液：蛋白胨20g，牛肉膏6g，乳糖10g，氯化鈉10g，溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L）2mL，蒸餾水1000mL，先將蛋白胨、牛肉膏、乳糖和氯化鈉溶于蒸餾水中，調整PH值為7.2-7.4，再加入2mL的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒立小試管的大試管中，每管10mL，115℃高壓滅菌20min。

伊紅美藍培養基：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氫二鉀2g，瓊脂25g，蒸餾水1000mL，伊紅水溶液（20g/L）20mL，美藍水溶液（5g/L）13mL，將蛋白胨，磷酸氫二鉀和瓊脂溶解于蒸餾水中，調整PH值為7.2-7.4，加入乳糖，115℃高壓滅菌20 min，冷卻至50℃左右加入伊紅和美藍溶液，混勻，傾注平皿。

2.4接種與培養

2.4.1水樣稀釋先充分混勻水樣，無菌操作吸取1mL水樣注入9mL滅菌生理鹽水中，混勻成1：10稀釋液，同法倍比稀釋1：100、1：1000、1：104、1：105、1：106的稀釋液。

2.4.2營養瓊脂接種用滅菌吸管分別吸取1mL未稀釋的水樣和各稀釋度的水樣，注入不同的滅菌平皿中，然后倒入15mL左右已融化并冷卻至45℃左右的營養瓊脂，立即輕輕旋搖平皿將水樣與培養基混勻，待培養基冷卻凝固后放入濕盒中在37℃培養48h后進行菌落計數。

2.4.3雙料乳糖蛋白胨培養液接種取10管雙料乳糖蛋白胨培養液，每管無菌接種10mL未稀釋的水樣，接種后5管置于37℃培養24h，作為總大腸菌群檢測，5管置于44.5℃培養24h，作為耐熱大腸菌群檢測。

2.4.4伊紅美藍瓊脂接種取雙料乳糖蛋白胨培養液產酸產氣管（37℃或44.5℃培養，培養液變黃，倒立小試管浮起，內含氣泡），用接種環蘸取少量培養液，在伊紅美藍瓊脂上進行細菌劃線分離接種，按接種的雙料乳糖蛋白胨培養液的培養溫度分別置于37℃或44.5℃培養24h。

3結果判定

3.1菌落總數判定

選擇平均菌落數在30～300之間的培養皿進行計數，如果所有稀釋度菌落數都>300，則計數最高稀釋度平皿菌落數；如果所有稀釋度的菌落數都<30，則計數最低稀釋度平皿菌落數；如果所有稀釋度平皿菌落數都不在30～300之間，則計數最接近30或300的平皿。計數后，再乘以稀釋倍數，得出每毫升水樣菌落總數（CFU/mL）。

3.2大腸菌群判定

觀察37℃培養的雙料乳糖蛋白胨培養液，產酸產氣者為大腸菌群疑似陽性管，疑似陽性管經37℃伊紅美藍瓊脂分離培養后觀察有紫黑色或邊緣淺紫紅色中心紫黑色，略帶金屬光澤的特征菌落，證實為陽性管，根據陽性管數，按表1判定每100mL水樣總大腸菌群最可能數（MPN/100mL）。

3.3耐熱大腸菌群判定

觀察44.5℃培養的雙料乳糖蛋白胨培養液，產酸產氣者為耐熱大腸菌群疑似陽性管，疑似陽性管經44.5℃伊紅美藍瓊脂分離培養后觀察有3.2中描述的特征菌落，證實為陽性管，同樣按表1判定每100mL水樣耐熱大腸菌群最可能數（MPN/100 mL）。

3.4結果

菌落總數、總大腸菌群、耐熱大腸菌群三項指標低于1.2中的指標限值報告水樣微生物檢測合格，高于則報告不合格。

4總結

兩年來，筆者定期對某種豬場、某種禽場進行飲用水微生物指標檢測，指導兩場合理進行飲水系統的清洗和消毒，種豬場仔豬黃白痢、種禽場禽腹瀉病的發生率明顯下降，同時減少了預防性投藥。建議養殖場將飲用水微生物檢測做為疫病綜合防控措施之一開展起來。