病毒組織細胞培養(yǎng)方法及注意事項

靳芹

摘要：細胞培養(yǎng)是病毒學實驗研究必不可少的重要工具和手段。本文以豬乙型腦炎病毒在豬腎上皮細胞（PK-15細胞）增殖培養(yǎng)為例，介紹一下病毒的細胞培養(yǎng)方法，和一些注意事項。

關鍵詞：細胞培養(yǎng)；PK-15細胞

隨著畜牧業(yè)的高速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，動物疫病也成為困擾廣大養(yǎng)殖戶的首要問題。檢測出明確的疫病類型，是做好養(yǎng)殖業(yè)防控治療的關鍵。對發(fā)病毒株的更深一步的研究，可有助于研制適于當前流行疫病的疫苗和藥物制劑。這樣，病毒前期的分離培養(yǎng)就尤為重要，因為病毒缺乏完整的酶系統，又無核糖體等細胞器，所以不能在任何無生命的培養(yǎng)液內生長。試驗動物、雞胚以及體外培養(yǎng)的組織細胞就成為人工增殖的基本工具。細胞培養(yǎng)與實驗動物和雞胚相比，不僅經濟、方便、省時、省力，而且能提供大量生物性穩(wěn)定的細胞群體，降低了外界因素的影響，使實驗結果更加準確可靠。

1病毒組織細胞培養(yǎng)方法

1.1細胞培養(yǎng)所需儀器設備

干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱、-80℃低溫冰柜、高壓消毒器、恒溫水浴箱、普通離心機、真空泵、蔡氏濾器、顯微鏡、無菌室、超凈工作臺、細胞培養(yǎng)瓶、移液管（1mL、5mL、10mL）等。

1.2病毒培養(yǎng)過程所需溶液的配制

1.2.1營養(yǎng)液的配制營養(yǎng)液是組織細胞中賴以生長和增殖的直接環(huán)境，不僅要求含有多種營養(yǎng)物質，而且必須保證適宜酸堿度、溫度、滲透壓和氣相等。以配制10mL營養(yǎng)液為例：需滅菌蒸餾水7.8mL、EME0.9mL、雙抗（青霉素和鏈霉素）0.2mL、犢牛血清1mL、Na 0.1mL，調PH值7.2-7.4。

1.1.2維持液配制（以10mL為例）需滅菌蒸餾水8.3mL、MEM0.9mL、雙抗（青霉素和鏈霉素）0.2mL、犢牛血清0.5mL、Na0.1mL調pH值7.2-7.4。

1.1.3消化液配制（以10 mL為例）滅菌蒸餾水9mL、胰酶1mL。

1.2 PK-15細胞復蘇

從液氮罐中取出凍存的PK-15細胞（約1.8mL）迅速放入40℃水浴鍋中（大約2min）使其溶解，然后放入離心機中1000rpm，離心5min，棄凍存液，用1mL吸管，吸培養(yǎng)液使細胞重新懸浮，吹打細胞，全部移入培養(yǎng)瓶，放37℃C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察結果：細胞都貼壁生長，均勻平鋪在瓶壁上，形狀整齊、輪廓清晰，在無菌操作臺，把細胞培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液倒掉，換維持液，培養(yǎng)24h，把原培養(yǎng)瓶中的維持液倒掉，把消化液分三次加入細胞培養(yǎng)瓶中，每次從細胞貼壁的一面開始消化（輕搖），四面都洗完，把消化液倒掉，把培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶，分裝成兩瓶。繼續(xù)按上述步驟進行細胞傳代培養(yǎng)。

1.3豬乙型腦炎病毒接種傳代好的PK-15細胞

取處理好的病毒組織，12000rpm離心10min，取上清接種于倒掉培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃感作1h（每隔15min慢慢搖動一次，使病毒與細胞充分作用）；同時做空白對照。1h后，把接毒瓶與對照瓶同時加維持液（維持液調pH7.6），放37℃溫箱，解毒12h后，接毒細胞無明顯變化，相對于對照細胞，維持液稍黃，16h后，維持液開始變渾濁，接毒20h后細胞有了明顯變化，細胞界限模糊不清晰，細胞的生長受到抑制，有些細胞有融合現象，已有兩個或三個細胞融合為一個細胞（這時，要在接毒細胞和對照細胞中均加入2mL NaHC03，調環(huán)境PH7.5-7.7，要使維持液保持一定的PH環(huán)境），接毒24h后，接毒細胞形狀變細長，36h后90%細胞已經圓縮，開始收毒，收的乙腦細胞毒放-80℃低溫冰柜凍36h，然后拿出凍融一次（-80℃病毒放4℃冰箱2min，然后融化再放入-80℃冰柜），3h后，取出病毒按上步驟融化分裝，為第一代病毒。取第一代病毒接種細胞，按以上操作步驟進行傳代。傳代到十代以上，可以保存病毒作為下一步試驗用毒。

2病毒組織細胞培養(yǎng)注意事項

1）培養(yǎng)液配制時，采用的動物血清是細胞生長所必須的營養(yǎng)物質，有很強的酸堿緩沖作用和促進細胞貼壁的作用。一般采用犢牛血清，但不是所有病毒都通用一種血清，比如犢牛血清就抑制細小病毒的生長，要改為5月齡以內的胎牛血清。所以，根據所增殖病毒的不同，加入其適宜的血清。營養(yǎng)液的PH值，細胞最適生長的PH范圍是7.0-7.4，細胞通常可耐受PH6.6-7.8較大范圍的變化，偏酸或偏堿的環(huán)境持續(xù)時間不宜超過24h，否則細胞很快老化。較堿的生長液更適于細胞貼壁，但培養(yǎng)時的PH應保持在7.2-7.4之間。

2）培養(yǎng)細胞所用培養(yǎng)瓶，移液管等玻璃器皿潔凈與否，對于細胞培養(yǎng)十分重要。必須經清水沖洗，再于1%優(yōu)質洗衣粉的水溶液內蒸煮30min，隨后刷洗，并用清水和蒸餾水分別沖洗5～6次以上，烘干。然后經包扎于160-170℃干燥滅菌2h，取出備用。

3）細胞培養(yǎng)和接毒后培養(yǎng)的內外環(huán)境一定要保持無菌，工作前后要紫外燈半小時殺菌，尤其是環(huán)境中不要感染支原體，否則，細胞培養(yǎng)將無法繼續(xù)。

4）一般細胞培養(yǎng)到5代以后，可以進行接毒。病毒傳代到13代以后基本穩(wěn)定，可以作為下一步試驗用毒。一般在接毒培養(yǎng)瓶內約有2/3的細胞發(fā)生折光性增強、凝縮不整及細胞核變形、破碎、脫落時，應立即收獲。在實際工作中，往往因病料中病毒含量少或病毒起初不適應在細胞內增殖，初代分離病變不明顯，但通過盲傳而逐步增強，從而達到分離病毒的目的。

5）不同的病毒，會有自己所敏感的增殖細胞。因此，實際工作中，我們要根據自己所研究的病毒，選擇適宜的培養(yǎng)細胞。病毒傳到多少代可以達到穩(wěn)定狀態(tài)，不同的病毒也會不同，要根據具體試驗結果而定。