重組人白細(xì)胞介素-11對(duì)雌激素周期性小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂和PCNA表達(dá)的影響

曹立軍，王進(jìn)

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 急診內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012；2. 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，山東 濟(jì)南 250012)

重組人白細(xì)胞介素-11對(duì)雌激素周期性小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂和PCNA表達(dá)的影響

曹立軍1，王進(jìn)2Δ

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 急診內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012；2. 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，山東 濟(jì)南 250012)

目的 研究重組人白細(xì)胞介素-11(rhIL-11)對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)的影響。 方法 采用雌激素周期性小鼠陰道上皮增殖銀屑病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图癙CNA免疫組化方法, 測(cè)定白細(xì)胞介素-11對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂和PCNA表達(dá)的影響。 結(jié)果 白細(xì)胞介素-11可顯著抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂(P<0.01)，并顯著抑制PCNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 白細(xì)胞介素-11可明顯抑制上皮細(xì)胞有絲分裂和PCNA的表達(dá)，對(duì)銀屑病等表皮過度增殖性異常病變有較好的防治作用。

重組人白細(xì)胞介素-11；銀屑病；有絲分裂；增殖細(xì)胞核抗原

銀屑病是一種常見的自身免疫性炎癥和慢性增殖性皮膚病，主要組織病理表現(xiàn)可見表皮內(nèi)角朊細(xì)胞增生周期變短、進(jìn)入增殖期的細(xì)胞異常增多[1-2]。重組人白細(xì)胞介素-11(recombinant human interleukin -11，rhIL-11)系通過基因重組工程而制得的具有高活性的生物制劑，對(duì)機(jī)體無明顯不良反應(yīng)，是一種多效性細(xì)胞因子[3-4]，具有抑制表皮異常增殖的調(diào)節(jié)作用[5]。研究前期發(fā)現(xiàn)其對(duì)角朊細(xì)胞分化不全有改善作用[6]，但其對(duì)銀屑病模型中細(xì)胞過度增殖的影響尚無研究報(bào)道。本研究通過皮下注射(sc)rhIL-11，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性銀屑病模型小鼠的陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響，并采用免疫組化法測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在陰道上皮細(xì)胞中的表達(dá)，旨在分析認(rèn)識(shí)銀屑病發(fā)展的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)開拓尋找防治此類疾病的高效新藥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種雌性健康小白鼠60只，平均體質(zhì)量(23±2)g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2013 0009。

1.1.2 藥品與試劑：重組人白細(xì)胞介素-11(齊魯制藥廠, 批號(hào)：20120301)；甲氨喋呤(MTX)(上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130201A)；己烯雌酚(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：120503)；秋水仙堿(云南植物藥業(yè)有限公司,批號(hào)：20110301)；小鼠PCNA單克隆抗體及試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)：BM0114)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：L8-80型低溫超速離心機(jī)(Beckman公司，美國)；BH-2型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械三廠)；石蠟切片機(jī)(AO spencer公司，美國)；切片漂烘溫控儀(安徽電子科學(xué)研究所)；MPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)(北京華海公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法：取昆明種雌性小鼠60只，隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、陽性對(duì)照甲氨喋呤組(MTX 1.5 mg/kg)、rhIL-11高、低劑量組(1.5 mg/kg，0.375 μg/kg)。除空白組ip (腹腔注射)NS 0.9%氯化鈉溶液外，其余各組均ip己烯雌酚0.2 mg/只，qd(每天1次),連續(xù)3 d，3 d后隔天1次ip己烯雌酚,并各組同時(shí)SC (皮下注射)給予相應(yīng)受試藥物，空白組和模型組 SC等量NS， 1次/天給藥，共12 d。第12天上午各組均注射秋水仙堿2 mg/kg(使細(xì)胞有絲分裂停滯在有絲分裂中期，以便進(jìn)行觀察計(jì)數(shù))，6 h 后處死動(dòng)物并解剖取陰道組織。各組動(dòng)物在給藥前和用藥后每周稱重1次。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與觀察方法

① 對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量變化的影響：在給藥前、給藥第6天、12天分別測(cè)量體質(zhì)量，觀察變化。

② 藥物對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響：取小鼠陰道組織，10%福爾馬林固定，常規(guī)HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)300個(gè)基底細(xì)胞中有絲分裂的細(xì)胞數(shù)，然后算出各給藥組有絲分裂指數(shù)(每100個(gè)基底細(xì)胞中出現(xiàn)有絲分裂的細(xì)胞數(shù))。

③ 藥物對(duì)小鼠陰道上皮PCNA表達(dá)的影響：嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)陰道上皮組織中PCNA的表達(dá)。采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法進(jìn)行。

④ PCNA的免疫組化檢測(cè)方法：在20×20光鏡下，以陽性染色的單個(gè)上皮細(xì)胞簇為一個(gè)陽性標(biāo)記，每例觀察切片1張，于豐富區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)相互非重疊視野進(jìn)行觀察。采用雙盲方式在光學(xué)顯微鏡下觀察。每組切片中以PBS緩沖液代替一抗進(jìn)行反應(yīng)的染色均為陰性著色。

⑤ 定量分析：將免疫組織化學(xué)染色結(jié)果輸入圖像分析系統(tǒng) (MPIAS 1000),每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同的視野，經(jīng)屏分割和濾波等處理，分別測(cè)量各組切片中陽性部位的相對(duì)含量(灰度值)，根據(jù)公式：OD=Log(空白灰度/標(biāo)本灰度)計(jì)算出平均光密度(MOD)值和S值，結(jié)果用平均光密度表示。

2 結(jié)果

2.1 rhIL-11對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 結(jié)果表明，rhIL-11在用藥過程中，小鼠體質(zhì)量變化不大，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明藥物對(duì)小鼠生長無明顯不良影響。而MTX在1.5 mg/kg時(shí)，在藥后第6天和第12天明顯降低小鼠體質(zhì)量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 rhIL-11對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

*P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.2 rhIL-11對(duì)雌性小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響 結(jié)果表明，模型組與空白組相比，陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明造模成功。同時(shí)可看出rhIL-11各劑量組和甲氨喋呤均可抑制小鼠陰道基底細(xì)胞的有絲分裂，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 rhIL-11對(duì)雌激素周期性小鼠陰道基底細(xì)胞有絲分裂和PCNA表達(dá)的影響

**P<0.01, 與模型組比，compared with model group；##P<0.01，與空白組比，compared with control group

2.3 rhIL-11對(duì)陰道上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)的影響 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠有明顯的PCNA陽性染色高度表達(dá)，rhIL-11高劑量組和MTX組僅有PCNA輕度表達(dá)，陽性反應(yīng)部位主要以基底細(xì)胞核為主，表現(xiàn)為棕黃色深染(見圖1)。將各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果輸入圖像分析系統(tǒng)(MPIAS 1000)分析平均光密度。rhIL-11高劑量組和MTX組與模型組相比，PCNA表達(dá)明顯減少(P<0.01，見表2)。

圖1 rhIL-11對(duì)雌激素周期性小鼠陰道上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響(×400)Fig.1 Effect of recombinant human interleukin-11 on the exprssion of PCNA of vaginal epithelial cells in estrone periodical mice(×400)

3 討論

銀屑病是一種增生性皮膚病，主要的病理特征為表皮過度增生、分化不良、伴有炎癥細(xì)胞浸潤。銀屑病角朊細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)表皮內(nèi)角朊細(xì)胞增生周期變短、進(jìn)入增殖期的細(xì)胞增多[1-2]。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種核蛋白，存在于增生活躍的細(xì)胞中，在G1后期和S期表達(dá)。雌激素化的小鼠陰道上皮處于增殖狀態(tài)，用PCNA標(biāo)記可從分子水平真實(shí)反映其增殖程度的變化，PCNA是石蠟切片上反映細(xì)胞增殖的主要指標(biāo)之一[7]，銀屑病患者表皮PCNA表達(dá)增強(qiáng)[8]。PCNA在表皮細(xì)胞異常增殖中的作用可能與促使非增殖期的角朊細(xì)胞大量進(jìn)入增殖周期有關(guān)[9]。本研究將PCNA的過度表達(dá)作為銀屑病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹饕笜?biāo)之一，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，以觀察藥物對(duì)細(xì)胞過度增殖的影響。PCNA的檢測(cè)采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法進(jìn)行。基本原理為用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合后，再用生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合于特異性抗原之上，再加入SABC復(fù)合物，通過鏈霉親合素上的結(jié)合位點(diǎn)與標(biāo)記在物素結(jié)合，最后加入底物DAB，通過過氧化物酶催化顯色。

在實(shí)驗(yàn)中可見到雌激素化小鼠陰道上皮PCNA表達(dá)明顯，基底層細(xì)胞和棘層細(xì)胞均有活躍表達(dá)，應(yīng)用rhIL-11治療后則明顯下降，陽性治療對(duì)照組注射MTX后PCNA表達(dá)更弱。可見MTX通過抑制免疫系統(tǒng)和葉酸還原酶，明顯阻止表皮細(xì)胞增殖時(shí)DNA合成，抑制細(xì)胞核的有絲分裂和過度增殖[10]。rhIL-11高劑量應(yīng)用對(duì)小鼠陰道上皮PCNA的表達(dá)有明顯抑制作用，其結(jié)果與對(duì)小鼠陰道上皮有絲分裂的影響完全一致，更進(jìn)一步證實(shí)了rhIL-11具有抑制表皮異常增殖的作用[5]，這可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及抑制細(xì)胞生長分化有關(guān)[11]，而且rhIL-11作為多效性因子，除促進(jìn)造血外還可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和抑制自身免疫等[3-4]。

有報(bào)道PCNA作為藥效學(xué)研究的指標(biāo)可能比常規(guī)組織學(xué)方法更為直觀和可靠[12-13]，本研究結(jié)果亦可證明這一點(diǎn)。本研究中rhIL-11未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，對(duì)體質(zhì)量變化影響不大，1.5 mg/kg的 rhIL-11可使小鼠體質(zhì)量呈增加趨勢(shì)，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而MTX 1.5 mg/kg則使動(dòng)物體質(zhì)量明顯下降，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明連續(xù)應(yīng)用rhIL-11對(duì)小鼠生長無明顯不良影響。rhIL-11系通過基因工程技術(shù)重組的高活性生物制劑，對(duì)機(jī)體無明顯不良反應(yīng)[14]。MTX雖對(duì)銀屑病有較強(qiáng)的治療作用，但因明顯的副作用(如肝纖維化，肝硬化等)而限制其臨床應(yīng)用。

進(jìn)一步探討rhIL-11對(duì)銀屑病動(dòng)物模型中其它細(xì)胞因子的影響，對(duì)于深入認(rèn)識(shí)銀屑病等自身免疫性疾病的分子發(fā)生機(jī)制，開拓尋找防治此類疾病的無交叉機(jī)制及副作用小的高效藥物具有重要的意義。

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(編校：王冬梅)

Effects of recombinant human interleukin-11 on the vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice and the expression of PCNA

CAO Li-jun1, WANG Jin2Δ

(1. Department of Emergency, Qilu Hospital of Shandong University, Ji’nan 250012, China;2.Institute of Pharmacology, Shandong University School of Medicine, Ji’nan 250012, China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) on the vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice and the exprssion of PCNA. MethodsThe vaginal epithelium mitosis of estrone periodical mice was used as the epidermis hyperplasia model, rhIL-11 action in regulating the epidermis hyperplasia was observed and the expression of PCNA was detected by immunohistochemistry. ResultsThe rhIL-11 significantly inhibited the mitosis of mouse vaginal epithelium, decreased the expression of PCNA(P<0.01). ConclusionThe rhIL-11 has good efficacy in treating the epidermis hyperplasia of psoriasis by inhibiting the mitosis of epithelium and decreasing the expression of PCNA.

recombinant human interleukin-11; psoriasis; mitosis; PCNA

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007GG3WZ02059)

曹立軍，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：心腦血管及抗炎免疫疾病，E-mail:csq44@sina.com；王進(jìn)，通信作者，男，博士，講師，研究方向：心腦血管及抗炎免疫疾病，E-mail：wjjinan@163.com。

R967

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.12