丙酮酸激酶在大腸癌組織中的表達水平研究

王翠瑤，張小玉，田苗苗，張秀梅

(錦州醫科大學 生物化學教研室，遼寧 錦州 121000)

丙酮酸激酶在大腸癌組織中的表達水平研究

王翠瑤，張小玉，田苗苗，張秀梅Δ

(錦州醫科大學 生物化學教研室，遼寧 錦州 121000)

目的 研究丙酮酸激酶M1型(PKM1)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在大腸癌臨床樣本中的表達水平，探討其與大腸癌發生發展的相關性。方法 分別采用Western blot法檢測大腸癌臨床標本和新鮮大腸癌組織及癌旁組織中PKM1 和 PKM2蛋白表達水平；分析PKM1、PKM2蛋白表達與大腸癌發生發展的相關性。結果 Western blot和免疫組化結果均顯示：與癌旁組織相比，癌組織中PKM1的表達水平明顯降低(P<0.05)，PKM2的表達水平明顯增高(P<0.05)。相關分析結果表明，PKM1與大腸癌患者年齡，性別，分期均無相關性，PKM2與病理分期密切相關(P<0.05)。結論 大腸癌組織中PKM1呈現低表達，PKM2高表達。且PKM2與大腸癌患者的病理分期成正相關。

丙酮酸激酶M1型 ；丙酮酸激酶M2型；大腸癌

惡性腫瘤由于其生長迅速，常常消耗大量的葡萄糖，即使在有氧的條件下也常常利用糖酵解來供能，這種代謝特征是70年前由Otto Warburg發現并首次報道，稱為Warburg效應或有氧糖酵解[1]。糖酵解水平提高幾乎是所有腫瘤組織和腫瘤細胞的生物學特性。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的一個限速酶，其主要功能是催化磷酸烯醇式轉變成丙酮酸。丙酮酸激酶已知具有L，R，M1，M2 4種同工酶，其表達差異取決于細胞和組織的代謝情況。L型丙酮酸激酶主要表達在糖異生旺盛的組織，如肝臟和腎臟；R型丙酮酸激酶主要表達在紅細胞中；M1型丙酮酸激酶表達于能量消耗快速耗氧量大的組織，如肌肉和腦；M2型丙酮酸激酶表達在核酸合成旺盛的組織，比如胚胎細胞、干細胞和腫瘤細胞[2-4]。本研究旨在檢測大腸癌臨床樣本中PKM1和PKM2的表達水平，以期為大腸癌的臨床早期診斷和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源：選取遼寧醫學院第一附屬醫院經大腸癌手術切除、并經病理確診的大腸癌標本95例，標本對應的患者手術前均未進行化療、放療及生物治療。另取遼寧醫學院第一附屬醫院26例大腸癌患者行手術切除的新鮮大腸癌組織和癌旁組織。

1.1.2 主要試劑：兔抗人的PKM1、PKM2的多克隆抗體購自Cell signal公司，辣根過氧化物酶偶聯的IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，免疫組化二抗試劑盒，DAB染色試劑盒購自中杉金橋公司。

1.1.3 儀器：Lumat LB 9507化學發光儀(德國Berthold technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測PKM1、PKM2蛋白表達水平：取臨床新鮮癌組織和癌旁組織，加蛋白裂解液冰上裂解15 min，提取組織總蛋白，測定蛋白濃度，-80 ℃保存備用。電泳前，加入SDS樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣，每孔蛋白含量30 μg，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用含5%BSA的TBST(pH7.4)室溫搖動溫育1 h進行封閉，封閉后的膜再分別與PKM1抗體、PKM2抗體(稀釋比為1:1000)4 ℃溫育過夜。經TBST洗滌后，辣根過氧化物酶偶聯的IgG作為二抗(稀釋比為1:5 000)室溫溫育2 h，洗膜后，ECL發光，Western blot成像系統采集圖像，計算灰度值。

1.2.2 免疫組化方法檢測PKM1、PKM2蛋白表達水平：脫蠟和水化：將大腸癌標本置于二甲苯中浸泡20 min，更換二甲苯后再浸泡20 min；無水乙醇中浸泡10 min；95%乙醇中浸泡5 min；90%乙醇中浸泡5 min；80%乙醇中浸泡5 min；再放入水中5 min。

抗原修復：采用高壓熱修復，在高壓鍋里加熱0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至噴氣后150 ℃ 2 min。

免疫組織化學染色：自然涼卻后，滴加3%H2O2，室溫靜置10 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫15 min。甩去多余液體。滴加一抗30 μL，室溫靜置1 h再4 ℃過夜。PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗，37 ℃ 1 h；PBS洗3次，每次10 min；滴加試劑C，室溫靜置1 h；PBS洗3次，每次10 min；DAB顯色1～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復染30 s，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

2 結果

2.1 Western blot法檢測26例腸癌樣本的PKM1及PKM2的蛋白表達水平 26例腸癌樣本中有17例PKM1的表達水平明顯低于癌旁組織，比例高達65.38%(P<0.05)。與癌組織相比，26例腸癌樣本中有16例PKM2的表達水平明顯升高，比例高達61.53%(P<0.05)。結果提示：在正常組織中，通常是表達PKM1；而在癌組織中，PKM2的表達水平明顯升高；說明PKM1和PKM2的異常表達與腸癌的發生發展密切相關。見圖1、表1、圖2、表2。

圖1 26例大腸癌組織和癌旁組織的PKM1蛋白表達水平比較N：癌旁組織；C：大腸癌組織Fig.1 Comparison of PKM1 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序號病例癌旁PKM1/β-actin癌序號病例癌旁PKM1/β-actin癌11.938±0.0541.234±0.074*140.417±0.0730.122±0.086*21.838±0.0980.334±0.028*150.923±0.0860.234±0.073*30.964±0.0721.024±0.035161.118±0.0431.235±0.08740.252±0.0570.862±0.068171.725±0.0321.078±0.056*51.138±0.0380.326±0.072*180.925±0.0540.568±0.064*60.414±0.0611.264±0.058191.434±0.0870.456±0.039*70.538±0.0650.144±0.056*200.916±0.0620.434±0.018*80.326±0.0730.156±0.053*210.837±0.0470.564±0.059*90.236±0.0350.342±0.073220.846±0.0290.478±0.051*100.236±0.0560.136±0.023230.346±0.0450.152±0.056*111.224±0.0231.028±0.043*240.175±0.0430.844±0.026120.535±0.0780.341±0.039*250.134±0.0542.348±0.076130.444±0.0760.878±0.057260.534±0.0660.321±0.039*

*P<0.05，與同組癌旁組織相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

圖2 26例大腸癌組織和癌旁組織的PKM2蛋白表達水平比較N：癌旁組織；C：大腸癌組織Fig.2 Comparison of PKM2 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序號病例癌旁PKM2/β-actin癌序號病例癌旁PKM2/β-actin癌10.128±0.0530.115±0.042140.634±0.0710.221±0.04620.243±0.0560.247±0.072150.134±0.0431.230±0.047*30.474±0.0720.324±0.051161.218±0.0562.135±0.035*40.134±0.0430.562±0.058*171.325±0.0532.878±0.056*51.038±0.0781.436±0.072*180.325±0.0281.568±0.056*60.114±0.0320.574±0.078*191.134±0.0360.534±0.04570.136±0.0660.446±0.022*200.906±0.0620.434±0.03480.114±0.0680.354±0.058*210.537±0.0460.364±0.05990.154±0.0710.236±0.024220.136±0.0250.436±0.032*100.236±0.0660.456±0.016230.134±0.0252.232±0.068*110.116±0.0760.358±0.023*240.365±0.0530.264±0.076120.134±0.0520.537±0.048*250.138±0.0660.518±0.085*130.534±0.0460.834±0.023*260.234±0.0580.621±0.068*

*P<0.05，與同組癌旁組織相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

2.2 免疫組化方法檢測PKM1及PKM2的蛋白表達水平 免疫組化染色結果顯示，PKM1(棕黃色顆粒)分布于胞漿，靠近核的區域，癌旁組織染色明顯深于癌組織。PKM2(棕黃色)分布在胞質或胞核，癌組織染色明顯深于癌旁組織。見圖3。

圖3 PKM1 和PKM2的蛋白表達水平(×200)Fig.3 The expression level of PKM1 and PKM2 protein(×200)

2.3 PKM1和PKM2與大腸癌發生發展的相關性 根據樣本的組化得分將樣本分為2組，弱(組化賦分小于3分的為弱)和強(組化賦分大于3小于7為強)，數據顯示：高表達的PKM2與pTNM分期(P=0.015)顯著相關，而與年齡、性別、大小、侵潤深度等無關。PKM1的表達水平與pTNM分期等均無關，見表3、表4。

表3 PKM2在大腸癌組織的表達

表4 PKM1在大腸癌組織的表達

3 討論

大多數正常組織在有氧條件下都是通過葡萄糖的有氧氧化獲取能量，只有在缺氧時才進行無氧糖酵解。腫瘤組織即使在氧供應充足時也主要是以無氧糖酵解獲取能量。腫瘤細胞發生這種代謝重編程與惡性腫瘤所處缺氧微環境和糖代謝酶譜變化，特別是糖酵解關鍵酶活性的改變密切相關[5-8]。PKM是糖酵解途徑中最后一個限速酶。有研究[9-10]表明：生長迅速的腫瘤細胞和正常細胞比較，其PKM2活力明顯升高。

本研究采用Western blot方法檢測了26例大腸癌樣本PKM1及PKM2的蛋白表達水平，結果顯示：PKM1的表達水平在癌旁組織中明顯高于癌組織，而PKM2的表達水平在癌組織中明顯高于癌旁組織。該結果表明：PKM2的表達水平在大腸癌中表達水平明顯升高，而PKM1的蛋白表達水平在大腸癌中則明顯降低，說明2者的表達可能與大腸癌的發生發展有關，與文獻報道相一致[11]。本研究采用免疫組化方法檢測了95例大腸癌組織的PKM1及PKM2的蛋白表達水平，結果顯示：與癌旁組織相比，PKM2的蛋白表達水平明顯升高，其表達水平與大腸癌的病理分期密切相關，而與性別、年齡、腫瘤大小等無關；PKM1的蛋白表達水平在癌旁組織略高于癌組織，但其表達水平與性別、年齡、病理分期均無關。綜上所述，大腸癌組織中PKM1和PKM2的的表達水平與大腸癌的發生發展密切相關。

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(編校：吳茜)

Study on the expression of PKM levels in colorectal cancer

WANG Cui-yao, ZHANG Xiao-yu, TIAN Miao-miao, ZHANG Xiu-meiΔ

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo study the expression level of PKM1 and PKM2 in colorectal cancer tissue and explore the relationship between colorectal cancer progression and their expression level.MethodsThe PKM1 and PKM2 protein expression levels in colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma were determined by Western blot and Immunohistochemisty method, and the relationship with colorectal cancer were discussed.ResultsWestern blot and Immunohistochemisty results all showed that, compared with adjacent noncancerous，the protein level of PKM1 decreases significantly in cancer tissues (P<0.05), while the protein level of PKM2 increases significantly in cancer tissues (P<0.05).The protein level of PKM1 is not relative with age，sex and stage of patients, but the protein level of PKM2 is relative with pTNM(P<0.05).ConclusionColorectal cancer tissues with low level of PKM1 and high level of PKM2, and PKM2 was related with TNM of patients.

PKM1; PKM2; colon cancer

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.12

遼寧省大學生創新課題(201410160012)

王翠瑤：女，本科，高級實驗師，研究方向：腫瘤分子生物學，E-mail：1140379451@qq.com；張秀梅，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：腫瘤分子生物學，E-mail：zhangxiumei9879@sina.com。

R736.1

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