SIRT1對卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響及可能機制

劉恒，葉麗平

(1.錦州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.遼河油田總醫(yī)院渤海院區(qū) 腫瘤診治中心，遼寧 盤錦 124010)

SIRT1對卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響及可能機制

劉恒1,2，葉麗平1Δ

(1.錦州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.遼河油田總醫(yī)院渤海院區(qū) 腫瘤診治中心，遼寧 盤錦 124010)

目的 分析沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)對人卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響，并探討可能的作用機制。方法 利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的卵巢癌CAOV3細胞，分為正常對照組、陰性對照組和SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組。RT-PCR和Western blot檢測SIRT1的mRNA和蛋白表達水平；MTT檢測RNA干擾SIRT1后24、48、72h CAOV3細胞增殖情況；流式細胞術(shù)檢測RNA干擾SIRT1后CAOV3細胞周期分布；Western blot檢測RNA干擾SIRT1后CAOV3細胞SIRT1、p53、p21蛋白表達水平和p53乙酰化狀態(tài)；免疫共沉淀檢測SIRT1蛋白和p53蛋白的相互作用。結(jié)果 與陰性對照組相比，SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組72 h后SIRT1的mRNA和蛋白表達水平減少(P<0.05)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組48、72 h后的細胞增殖率明顯降低(P<0.01)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組S期細胞在細胞周期中所占比例顯著減少(P<0.01)，G1期細胞則明顯增加(P<0.01)；SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組p53和p21蛋白表達水平顯著升高，p53處于高乙酰化狀態(tài)(P<0.01)；在卵巢癌CAOV3細胞中SIRT1蛋白與p53蛋白存在相互作用。結(jié)論 通過特異性干涉SIRT1的表達能夠抑制卵巢癌CAOV3細胞的增殖，其機制可能為RNA干擾下調(diào)SIRT1的表達后，p53蛋白處于高乙酰化狀態(tài)，繼而增強了p53蛋白依賴的p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活，從而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖。

SIRT1；RNA干擾；卵巢癌；CAOV3；p53；p21

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的，屬于sirtuin家族，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的組蛋白去乙酰化酶[1]。SIRT1 參與體內(nèi)多種重要的生理病理過程，在急性髓細胞白血病、前列腺癌、骨癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中，內(nèi)源性SIRT1的表達明顯高于正常組織，SIRT1在腫瘤發(fā)生過程中可能起到癌基因的作用[2-4]。另一方面，SIRT1在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、膀胱癌中表達下調(diào)，提示SIRT1可能起到抑癌基因的作用[5-6]。因此，SIRT1在各種腫瘤組織中呈現(xiàn)異質(zhì)性表達，通過多種調(diào)控機制發(fā)揮作用。例如SIRT1與Wnt和Notch等多種信號通路中的NF-κB、c-Myc、p53等蛋白存在相互作用，共同參與細胞周期的調(diào)控、參與炎癥反應、抑制細胞凋亡等，進而發(fā)揮對基因的調(diào)控作用[7-8]。SIRT1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程中扮演什么樣的角色并不明確。

有研究表明SIRT1在惡性卵巢癌組織中的表達水平明顯高于良性腫瘤組織[9]，但SIRT1在卵巢癌細胞中的作用還未見報道。SIRT1在卵巢癌的組織和細胞水平上表型是否一致？本研究旨在通過在卵巢癌CAOV3細胞株中特異性干涉SIRT1的表達，探討下調(diào)SIRT1表達對人卵巢癌CAOV3細胞增殖的影響，通過檢測SIRT1蛋白和p53蛋白之間是否存在相互作用，研究SIRT1在卵巢癌CAOV3細胞中的作用機制，為RNA干擾治療卵巢癌提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人卵巢癌細胞株CAOV3購于齊氏生物科技有限公司。

1.1.2 試劑：Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；SIRT1 siRNA(上海吉瑪公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone公司)；SIRT1和p53抗體(Santa cruz公司)；p21抗體和Ac-p53 (lys382) 抗體(Cell signal公司)；GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Protein A Sepharose TM CL-4B(AB公司)；MTT、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)公司)。

1.1.3 儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；PCR擴增儀(Mastercycler nexus X2，Eppendorf公司)；流式細胞儀(XL/XL-MCL,貝克曼庫爾特有限公司)；水浴式電轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(Bio-Rad，美國)；IBOX-600全自動凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：CAOV3細胞培養(yǎng)條件為DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、飽和濕度、37 ℃和5%CO2。

1.2.2 SIRT1 siRNA的合成和轉(zhuǎn)染：針對人SIRT1的mRNA序列(GenBank No.NM_012238)設(shè)計特異的SIRT1 siRNA序列：正義鏈5’-GAAGUUGACCUCCUCAUUGUdTdT-3’，反義鏈 5’-ACAAUGAGGAGGUCAACUUCdTdT-3’[10]，陰性對照序列：正義鏈5’-CUUACGCUGAGUACUUUCGA-3’，反義鏈 5’-UCGAAAGUAC-UCAGCGUAAG-3’由上海吉瑪公司純化合成。卵巢癌CAOV3細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分為正常對照組、陰性對照組和SIRT1-siRNA轉(zhuǎn)染組，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，按照說明書進行。

1.2.3 RT-PCR方法檢測SIRT1的mRNA表達水平:利用Trizol提取各組CAOV3細胞總RNA，并測定RNA濃度。按實驗室常規(guī)方法進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。SIRT1引物為F：5’-TGGCACA-GATCCTCGAACAA-3’和R：5’-TTTGGATTCCC-GCAACCTGT-3’，預期片段長度為491bp；GAPDH引物為F：5’-CGGAGTCA-ACGGATTTGGTCGTAT-3’，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，預期片段長度為306 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；30個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。Image J軟件進行灰度值分析。基因mRNA表達水平以每一樣品與其內(nèi)參GAPDH灰度比值表示，實驗重復3次。

1.2.4 MTT法檢測CAOV3細胞生長增殖:將各組轉(zhuǎn)染CAOV3細胞消化離心，以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，完全培養(yǎng)基總量為200 μL。每組細胞設(shè)6個復孔，檢測時間點為24、48、72 h；每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；各孔加入150 μL DMSO，搖床上低速慢搖15 min；酶標儀上A490nm處測定每孔的A值；根據(jù)A值的大小來計算增殖率。公式如下：細胞增殖率=實驗組A值/陰性對照組A值×100%。實驗重復6次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期:將處于對數(shù)生長期的CAOV3細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后細胞數(shù)達到孔底面積80%時進行轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染72 h后用胰蛋白酶消化，收集細胞，離心5 min，加1 mL 4 ℃預冷的70%冷乙醇固定，4 ℃過夜。離心，加入250 μg/mL的RNase A，4 ℃孵育30 min，向細胞懸液中加入50 μL PI，4 ℃避光孵育30 min；流式細胞儀檢測分析。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達:取各組細胞，加蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。加入5×SDS樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS(pH 7.4)封閉濾膜2 h，再分別與anti-SIRT1抗體(稀釋比為1:500)、anti-Ac-p53 (lys382)抗體(稀釋比為1:500)、anti-p53抗體(稀釋比為1:500)、anti-p21抗體(稀釋比為1:1000)和anti-GAPDH(稀釋比為1:1000)，4 ℃溫育過夜。TTBS洗滌3次后，HRP偶聯(lián)的IgG(稀釋比為1:5000)室溫溫育2 h，搖床上10 min洗膜3次，ECL發(fā)光法顯色。實驗重復3次。

1.2.7 免疫共沉淀檢測SIRT1和p53之間相互作用:CAOV3細胞培養(yǎng)48 h后，5×含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞。將細胞12，000 g離心25 min；取上清定量蛋白，取等量蛋白沉淀；在EP管中加入20 μL裂解液和5 μL 5×SDS上樣緩沖液，煮沸，-20 ℃保存留作上樣。取20 μL預冷混懸的蛋白A/G瓊脂糖珠子和2 μL與免疫沉淀時使用的抗體同種屬的普通IgG(normal IgG)，加入細胞上清液中，離心30 min。取上清，分出50 μL留存，補足體積至0.5 mL，加入4 μL p53抗體，孵育3 h后加入50 μL蛋白A/G瓊脂糖珠子繼續(xù)孵育2 h；離心棄上清；剩余的瓊脂糖珠子用PBS清洗，離心3 min。如上，反復洗5次，以上操作均在4 ℃條件下進行。最后一次離心之后，加20 μL 2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后，離心，取上清液準備進行電泳。SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜同上，SIRT1一抗孵育過夜，洗膜3次后，二抗孵育2 h，洗膜后，ECL發(fā)光檢測蛋白表達，實驗重復2次。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾對SIRT1 mRNA和蛋白水平的影響 與正常對照組相比，實驗組SIRT1 mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.01)，而陰性對照組無明顯區(qū)別，見圖1、表1。

圖1 CAOV3細胞轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后SIRT1的mRNA(A)和蛋白(B)表達水平1：正常對照組；2：陰性對照組；3：SIRT1-siRNA組Fig.1 Expression levels of SIRT1 mRNA(A) and protein(B) in CAOV3 cells transfected with siRNA SIRT11:Normal control group 2：Negative control group 3：SIRT1-siRNA transfected group

組別SIRT1/GAPDHmRNASIRT1/GAPDHprotein正常對照組0.49±0.070.67±0.15陰性對照組0.45±0.090.62±0.11SIRT1siRNA組0.23±0.09*0.28±0.10*

*P<0.01，與陰性對照組相比，compared with negative control group

2.2 SIRT1干擾對CAOV3細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 24 h后CAOV3細胞增殖率為(94.65±5.8)%，轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 48 h后CAOV3細胞增殖率為(75.72±7.9)%，而轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 72 h后細胞增殖率為(64.62±11.1)%。細胞增殖率明顯降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA后不同時間點CAOV3細胞增殖率Fig.2 Cell proliferation rate of CAOV3 cells at different time points after transfection with SIRT1-siRNA ±s,n=6)

2.3 SIRT1-siRNA對CAOV3細胞周期的影響 與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染SIRT1-siRNA的CAOV3細胞株中G1期細胞增加，S期細胞減少(P<0.01)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染SIRT1-siRNA對CAOV3細胞周期的影響

*P<0.01，與陰性對照組比較，compared with negative control group

2.4 SIRT1-siRNA對細胞周期相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，SIRT1-siRNA組p53、p21蛋白的表達水平顯著增加(P<0.01)，p53處于高乙酰化狀態(tài)，見圖3、表3。

圖3 Western blot檢測CAOV3細胞中相關(guān)蛋白表達1：正常對照組；2：陰性對照組；3：SIRT1-siRNA組Fig.3 Expression of related proteins in CAOV3 cells by Western blot1:Normal control group;2:Negative control group;3:SIRT1-siRNA transfected group

組別p53/GAPDHproteinAc-p53/GAPDHproteinp21/GAPDHprotein正常對照組0.51±0.120.32±0.100.36±0.09陰性對照組0.49±0.090.30±0.080.33±0.08SIRT1-siRNA組0.69±0.14*0.47±0.08*0.49±0.09*

*P<0.01，與陰性對照組比較，compared with negative control group

2.5 SIRT1和p53的相互作用研究 經(jīng)p53抗體孵育后，120 kDa位置上檢測到SIRT1的表達條帶，Input組也檢測到相應的條帶，表達量比IP組高，但陰性對照IgG組沒有檢測到條帶。表明IRT1和p53之間存在相互作用。見圖4。

圖4 免疫共沉淀檢測SIRT1與p53的相互作用Fig.4 Immunoprecipitation results of SIRT1 and p53

3 討論

SIRT1屬于Ⅲ類去乙酰化酶家族中的一員，可以去乙酰化眾多的蛋白質(zhì)，參與生物體內(nèi)各種各樣的生物學過程。近年來，關(guān)于SIRT1在腫瘤中的作用，由于實驗室條件和細胞系的差異，結(jié)果千差萬別[11]。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個非常復雜的病理過程，涉及多種生物學和遺傳學因素，有研究表明SIRT1在這一過程中起著重要作用[12]，但SIRT1在卵巢癌中的具體機制如何尚不明確。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)染針對人SIRT1特異靶序列的siRNA，探討下調(diào)SIRT1的表達對CAOV3細胞增殖的影響及其可能機制。RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示RNA干擾SIRT1 可明顯降低內(nèi)源性SIRT1的mRNA和蛋白表達水平，說明SIRT1-siRNA可明顯下調(diào)SIRT1的表達，有一定的特異性。MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA 48h和72 h后細胞增殖率明顯下降，說明干擾SIRT1能抑制細胞生長。流式細胞結(jié)果表明，SIRT1-siRNA干擾組G1期細胞明顯增加，表明細胞周期被阻滯在G1期，間接表明干擾SIRT1可抑制CAOV3細胞增殖。

有研究表明，在細胞氧化應激狀態(tài)和發(fā)生DNA損傷時，SIRT1的表達增加可抑制由p53蛋白介導的細胞凋亡和細胞周期阻滯[13]；采用特異性抑制劑抑制SIRT1蛋白的表達，使p53蛋白處于高乙酰化狀態(tài)，增強了p53蛋白依賴的轉(zhuǎn)錄激活作用，增加了細胞對應激狀態(tài)的敏感性[14]。但在卵巢癌CAOV3細胞中SIRT1和p53的關(guān)系尚不清楚。本實驗采用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染CAOV3細胞，p53蛋白表達水平明顯升高，說明p53蛋白的激活調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平，與Sun 等[15]結(jié)果一致。同時應用乙酰化p53(lys382)抗體和p21抗體檢測下調(diào)SIRT1表達后p53的乙酰化狀態(tài)和p21蛋白的表達水平，結(jié)果表明SIRT1被干涉后p53處于高乙酰化狀態(tài)，p21蛋白表達水平顯著上調(diào)，說明抑制SIRT1的表達后，p53被快速乙酰化，進而增強了p53依賴的轉(zhuǎn)錄激活，尤其是p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活。應用免疫共沉淀方法表明CAOV3細胞中SIRT1和p53蛋白存在相互作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明下調(diào)SIRT1的表達可抑制卵巢癌CAOV3細胞的增殖，阻滯細胞周期進程，且SIRT1和p53存在相互作用，說明SIRT1特異結(jié)合p53并使其去乙酰化，導致p53介導的轉(zhuǎn)錄激活的負調(diào)控，特別是p53介導的p21轉(zhuǎn)錄激活。這些結(jié)果提示了SIRT1可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到癌基因的作用，其作用機制可能與調(diào)控p53/p21通路相關(guān)。

[1] Blander G,Guarente L.The Sir2 family of protein deacetylases[J].Annu Rev Biochem,2004,73(2):417-435.

[2] Kim MJ,Hong KS,Kim HB,et al.Ku70 acetylation and modulation of c-Myc/ATF4/CHOP signaling axis by SIRT1 inhibition lead to sensitization of HepG2 cells to TRAIL through induction of DR5 and down-regulation of c-FLIP[J].Int J Biochem Cell Biol,2013,45(3):711-723.

[3] Mvunta DH,Miyamoto T,Asaka R,et al.Overexpression of SIRT1 is Associated With Poor Outcomes in Patients With Ovarian Carcinoma[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2016 Feb 9.[Epub ahead of print]

[4] Zhang C,Qu S,Wei X,et al.HSP25 down-regulation enhanced p53 acetylation by dissociation of SIRT1 from p53 in doxorubicin-induced H9c2 cell apoptosis[J].Cell Stress Chaperones,2016,21(2):251-260.

[5] Feng Y,Liu T,Dong SY,et al.Rotenone affects p53 transcriptional activity and apoptosis via targeting SIRT1 and H3K9 acetylation in SH-SY5Y cells[J].J Neurochem,2015,134(4):668-676.

[6] Anastasiou D,Krek W.SIRT1:linking adaptive cellular responses to aging-associated changes in organismal physiology[J].Physiology (Bethesda),2006,21:404-410.

[7] Nemoto S,Fergusson MM,Finkel T.SIRT1 functionally interacts with the metabolic regulator and transcriptional coactivator PGC-1{alpha}[J].J Biol Chem,2005,280(16):16456-16460.

[8] Rodgers JT,Lerin C,Haas W,et al.Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1[J].Nature,2005,434(7029):113-118.

[9] Bordone L,Motta MC,Picard F,et al.Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in pancreatic beta cells[J].PLoS Biol,2006,4(2):e31.

[10] Chen D,Steele AD,Lindquist S,et al.Increase in activity during calorie restriction requires Sirt1[J].Science,2005,310(5754):1641.

[11] Yuan Z,Zhang X,Sengupta N,et al.SIRT1 regulates the function of the Nijmegen breakage syndrome protein[J].Mol Cell,2007,27(1):149-162.

[12] Wang RH,Sengupta K,Li C,et al.Impaired DNA damage response,genome instability,and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice[J].Cancer Cell,2008,14(4):312-323.

[13] Pfluger PT,Herranz D,Velasco-Miguel S,et al.Sirt1 protects against high-fat diet-induced metabolic damage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(28):9793-9798.

[14] Banks AS,Kon N,Knight C,et al.Sirt1 gain of function increases energy efficiency and prevents diabetes in mice[J].Cell Metab,2008,8(4):333-341.

[15] Sun C,Zhang F,Ge X,et al.SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B[J].Cell Metab,2007,6(4):307-319.

(編校：吳茜)

Effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism

LIU Heng1,2, YE Li-ping1Δ

(1.Department of Pathophysiology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Liaohe Oil Field General Hospital, Panjin 124010, China)

ObjectiveTo observe the effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism.MethodsOvarian cancer CAOV3 cells were transfected the Lipofectamine 2000 and were divided into normal control group，negative control group and SIRT1-siRNA group.The mRNA and protein expression levels of SIRT1 were detected by RT-PCR and Western blot.MTT method was used to detect the proliferation of RNA interference at 24h，48h and 72h，respectively.The distribution of CAOV3 cell cycle phase after RNA interference of SIRT1 for 72 hours was detected by flow cytometry.SIRT1，p53，p21 protein expression and p53 acetylation status were detected by Western blot with RNA interference of SIRT1 after 72 hours.The interaction between SIRT1 and p53 protein was verified by immunoprecipitation in CAOV3 cells.ResultsCompared with negative control group，the expression of mRNA and protein of SIRT1 in SIRT1-siRNA group decreased after transfection of SIRT1 for 72 hours.The survival rate of CAOV3 cells in SIRT1-siRNA group decreased significantly at 48 hours and 72 hours (P<0.01).The proportion of Sphase cells in CAOV3 cells transfected with SIRT1-siRNA for 72h was significantly decreased (P<0.01)，while the G1phase cells were significantly increased (P<0.01)，and the cells arrested in the G1phase.The expression of p53 and p21 proteins were significantly increased and the p53 was in higher acetylation status after transfection with SIRT1-siRNA for 72 hours (P<0.01).SIRT1 was interacted with p53 protein in CAOV3 cells confirmed by co-immunoprecipitation.ConclusionDownregulation of SIRT1 expression can inhibit the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells，which maybe connected with p53 at high acetylation status，and enhancing p53-dependent p21 transcriptional activation，thus blocking the cell cycle and inhibiting the cell proliferation.

SIRT1; siRNA; ovarian cancer; CAOV3; p53; p21

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.13

劉恒，女，碩士在讀，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導，E-mail: 59588673@qq.com。葉麗平，通信作者,女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：細胞信號轉(zhuǎn)導，E-mail: 43120890@qq.com

R581.3

A