告達庭聯合吉非替尼逆轉HGF誘導的非小細胞肺癌對EGFR-TKI的獲得性耐藥研究

范方田，卞慶亞，吳紅雁Δ

(1.南京中醫藥大學 翰林學院，江蘇 泰州 225300；2.鹽城衛生職業技術學院 藥學院，江蘇 鹽城 224005)

告達庭聯合吉非替尼逆轉HGF誘導的非小細胞肺癌對EGFR-TKI的獲得性耐藥研究

范方田1，卞慶亞2，吳紅雁2Δ

(1.南京中醫藥大學 翰林學院，江蘇 泰州 225300；2.鹽城衛生職業技術學院 藥學院，江蘇 鹽城 224005)

目的 探討告達庭聯合吉非替尼對肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor ，HGF)誘導的非小細胞肺癌PC-9細胞對吉非替尼耐藥的效應及可能機制。方法 利用外源性HGF及與MRC-5共培養誘導PC-9細胞對EGFR-TKIs耐藥模型；MTT法考察告達庭對HGF誘導的PC-9細胞耐吉非替尼的逆轉作用； Western blot檢測告達庭聯合吉非替尼逆轉HGF誘導PC-9細胞耐藥的機制。結果 外源性HGF和MRC-5均可誘導PC-9對吉非替尼的耐藥作用，降低相對抑制率(P<0.05)；在HGF存在的情況下，單用告達庭(0～32 μM)和吉非替尼(1 μM)均不能顯著抑制PC-9的增殖，而告達庭聯合吉非替尼能劑量依賴性抑制PC-9增殖(P<0.05)。告達庭聯合吉非替尼下調Met及PI3K/AKT磷酸化水平(P<0.05)。結論 告達庭能逆轉HGF誘導的PC-9細胞對吉非替尼的耐藥，其機制可能與其抑制Met/PI3K/AKT通路有關。

非小細胞肺癌；細胞增殖；吉非替尼：告達庭

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)如吉非替尼和厄洛替尼，明顯改善了非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的生存率，尤其對于含有EGFR基因突變的腫瘤患者，可以從EGFR-TKIs治療中明顯獲益[1]。然而，幾乎所有對EGFR-TKIs初始治療敏感的EGFR基因突變的患者，經過1年的治療后都不可避免地出現病情惡化，臨床上定義為EGFR-TKIs獲得性耐藥[2]。因此，迫切需要尋找新的治療策略來克服EGFR-TKIs獲得性耐藥。

告達庭(Gaudatin)是從傳統補益中藥白首烏(耳葉牛皮消)中提取的一種C21甾體苷元，研究發現其具有較強的抗腫瘤活性；它能抑制肺癌A549細胞增殖并可誘導肺癌細胞發生凋亡[3]；告達庭具有抑制SGC-7901胃癌細胞增殖的活性并且可以誘導胃癌細胞凋亡[4-5]。告達庭可增強TRAIL誘導的HepG2細胞凋亡[6]。本研究通過探討吉非替尼聯合告達庭對體外誘導吉非替尼獲得性耐藥的NSCLC細胞PC-9的抗腫瘤效應及其可能的機制，以期從天然產物中尋找能克服EGFR-TKIs獲得性耐藥的活性成分，為NSCLC的臨床聯合用藥治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人肺癌PC-9細胞株及人胚肺成纖維細胞MRC-5購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.2 主要藥物：告達庭購自南京森貝伽生物科技有限公司，吉非替尼由美國路易斯安那州立大學黃世樂實驗室惠贈，人重組肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)購自Peprotech公司，藥物用DMSO溶解配制成濃度為10 mmol/L的濃縮液，-20 ℃冰箱保存，臨用前用細胞培養液配成所需濃度用于所有的實驗中。

1.1.3 試劑：胎牛血清、DMEM和RPMI-1640培養液購自美國Invitrogen公司，DMSO、MTT和碘化丙啶購自美國 Sigma公司，磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和 BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自碧云天公司，兔抗人磷酸化EGFR和EGFR、磷酸化MET和MET、磷酸化AKT和AKT、磷酸化PI3Kp85和PI3K p85多克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蛋白質印跡法檢測用的化學發光劑購自美國 Millipore 公司。

1.1.4 儀器：超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司，型號：SW-CJ-ZFD)；CO2培養箱(美國Thermo，型號：03793-6738)；倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss，型號：Discovery.V20)；超低溫冰箱(美國Nuaire，型號：Nu-6511)；酶標儀(美國MD，型號：SPECTRA MAX 190)；電泳儀(美國Bio-Rad，型號：Mini Protean 3 Cell)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad，型號：GelDoc 2000) 0.22 μm濾膜(邁博瑞生物膜技術有限公司)；

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：實驗所用細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和終質量濃度為100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液或RPMI-1640培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞進行實驗。PC-9細胞(包括藥物處理組)與MRC-5成纖維細胞共培養在直徑8 mm的Transwell小室(Corning)進行，PC-9細胞(104個/孔)置于小室底部，MRC-5細胞置于小室上部，培養72 h后，小室上部細胞移去，小室底部的PC-9細胞用MTT檢測增殖情況。

1.2.2 MTT檢測藥物對細胞增殖的影響

① 外源性加入HGF：有報道外源性加入HGF可以誘導PC-9細胞對吉非替尼耐藥[7-8]，本實驗取對數生長期的PC9細胞，調整細胞密度為4×104個/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，培養24 h后，按組別分別給予藥物干預。分組如下：Caudatin；HGF+Caudatin；Caudatin+Gefitinib；HGF+Caudatin+Gefitinib；各組分別加入不同濃度的告達庭(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μM)，吉非替尼(1 μM)和HGF(20 ng/mL)的濃度固定，各組設6個復孔。細胞繼續培養48 h后，加入MTT溶液10 μL/孔(終質量濃度為5 mg/mL)，繼續培養4h后，加入DMSO(150 μL/孔)，振蕩10 min，使紫色結晶完全溶解，在酶聯免疫檢測儀上檢測490 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計算相對細胞存活率(%)=(A給藥孔/A對照孔)×100%，抑制率(%)=100%-相對存活率(%)。

② PC-9細胞與成纖維細胞MRC-5共培養：有報道成纖維細胞能產生HGF也可誘導PC-9細胞對吉非替尼耐藥[8]，本實驗考察告達庭對PC-9細胞與MRC-5共培養后增殖的影響，共培養方法請見1.2.1細胞培養部分，MTT方法同①。分組如下：Control、Gefitinib、Caudatin、Caudatin+Gefitinib。濃度：告達庭32 μM、吉非替尼1 μM。

1.2.3 Western blot檢測藥物處理后 PC9細胞中蛋白及磷酸化水平的表達 Met及其下游的PI3K/AKT信號通路在HGF誘導的NSCLC細胞對EGFR-TKIs的耐藥中發揮重要作用[7,9-10]。本實驗采用Western blot檢測藥物作用后對EGFR及Met相關信號通路蛋白的影響。取對數生長期的PC-9細胞，接種于100 mm2的培養皿中，1×106個細胞/培養皿；細胞培養24 h后進行實驗分組和藥物處理。分組如下：Control、Caudatin、Gefitinib、Caudatin+Gefitinib；HGF、HGF+Caudatin、HGF+Gefitinib、HGF+Caudatin+ Gefitinib。濃度：告達庭32 μM、吉非替尼1 μM和HGF 20 ng/mL。收集藥物處理48 h后的PC-9細胞，PBS洗滌細胞3次，以含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg/孔蛋白在7.5%～12%SDS-PAGE電泳分離，然后轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉溶液于室溫下封閉反應2 h，加入1:1000稀釋的一抗抗體及1:1000稀釋的GAPDH(內參)抗體，4 ℃反應過夜； TBST洗膜后，加入1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗，室溫反應2h；TBST洗膜3次后，置于Bio-Rad凝膠成像儀中，加入化學發光劑進行化學顯色，分析蛋白條帶的位置及表達的情況，采用Photoshop 5.0軟件對蛋白條帶的灰度掃描后進行半定量分析，結果采用與對應內參的相對比值。

2 結果

2.1 告達庭逆轉HGF誘導的PC-9細胞對EGFR-TKIs的耐藥 單獨加入告達庭(Control)在32 μM濃度范圍內，對PC-9細胞增殖變化無顯著影響，在加入吉非替尼(1 μM)后，細胞增殖明顯受到抑制(Control組vs.吉非替尼組，P<0.05)；在加入HGF (20 ng/mL)后，不加告達庭(0 μM)時，可見PC-9細胞對吉非替尼(1 μM)產生耐藥，隨著告達庭濃度逐漸增加到32 μM時，細胞增殖抑制越來越明顯，在32 μM時的抑制率與不加HGF的Gefitinib組的相當[Caudatin+Gefitinib組相對抑制率(67.13±0.72)%vs.Caudatin+Gefitinib+HGF組相對抑制率(69.24±1.95)%]。見圖1。

圖1 吉非替尼和告達庭對PC-9細胞的增殖抑制作用±s)Fig.1 Effect of Caudatin and Gefitinib on proliferation of ±s)

2.2 告達庭逆轉與MRC-5共培養的PC-9細胞對EGFR-TKIs的耐藥 PC-9細胞與MRC-5細胞共培養后，對吉非替尼產生耐藥[與Medium相比，共培養體系中Gefitinib組對細胞的相對抑制率(7.03±0.81)%,遠低于Medium對照體系中的相對抑制率(57.24±2.69)%，P<0.01]，但是Caudatin+Gefitinib組能明顯抑制細胞增殖[共培養體系中，Caudatin+Gefitinib組對細胞的相對抑制率(53.63±2.47)%vs.Gefitinib組的相對抑制率(7.03±0.81)%,P<0.01]，逆轉了MRC-5共培養后PC-9細胞對吉非替尼的耐藥。見圖2。

圖2 吉非替尼和告達庭與MRC-5共培養后的PC-9細胞的增殖抑制作用NS: P>0.05,*P<0.05Fig.2 Effect of Caudatin and Gefitinib on proliferation ofNS: P>0.05,*P<0.05

2.3 告達庭聯合吉非替尼用藥對PC-9 細胞Met/PI3K/Akt通路的影響 本實驗檢測了各組藥物作用后對EGFR及Met相關信號通路關鍵蛋白表達水平的影響。見圖3、表1。

圖3 吉非替尼和告達庭對PC-9細胞中PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Caudatin and Gefitinib on expression of PI3K/Akt pathway in PC-9

GroupEGFRp-EGFRMetp-MetP13Kp-P13KAKTp-AKTControl1.32±0.121.03±0.461.30±0.940.35±0.150.91±0.830.31±1.070.84±0.380.57±0.43Caudatin1.25±0.361.08±0.471.28±0.190.01±0.01*0.85±0.060.23±0.490.78±0.520.56±0.34Gefitinib1.15±0.780.10±0.21*1.06±0.450.32±0.120.83±0.340.35±0.650.75±0.870.53±0.76Caudatin+Gefitinib1.20±0.290.22±0.37*1.01±0.130.05±0.36#0.87±0.920.21±0.570.81±0.140.02±0.02#HGF1.02±0.030.90±0.071.04±0.851.50±0.04*0.83±0.261.16±0.13*0.79±0.251.00±0.76*HGF+Caudatin1.16±0.431.27±0.821.15±0.860.01±0.01△0.84±0.230.21±0.64△0.80±0.710.52±0.91△HGF+Gefitinib1.01±0.080.24±0.09△1.23±0.741.05±0.17#0.88±1.010.28±0.26△0.71±0.070.51±0.39△HGF+Caudatin+Gefitinib1.10±0.840.27±0.061.03±0.900.02±0.01▲0.70±0.050.01±0.01▲0.61±0.090.01±0.01▲

*P<0.05，與Control組比較，compared with Control group;#P<0.05，與Gefitinib組比較，compared with Gefitinib group;△P<0.05，與HGF組比較，compared with HGF group;▲P<0.05，與HGF+Gefitinib組比較，compared with HGF+Gefitinib group

HGF誘導PC-9耐Gefitinib機制驗證：與Control組比較，HGF組激活Met, P13K及AKT磷酸化(P<0.05)，與Gefitinib組比較，HGF+Gefitinib激活Met磷酸化(P<0.05)，這說明HGF能夠激活Met/PI3K/AKT信號通路，誘導Gefitinib耐藥。

Caudatin對Met/PI3K/AKT信號通路的影響：基礎水平下，與Control組比較，Caudatin組顯著降低Met磷酸化(P<0.05)；與Gefitinib組比較，Caudatin+Gefitinib顯著降低p-Met和p-Akt的表達水平(P<0.05)。在HGF誘導的情況下，與HGF組比較，HGF+Caudatin組顯著降低p-Met、p-PI3K和p-Akt的表達水平(P<0.05)。這說明Caudatin 能抑制Met/PI3K/AKT信號通路。

Caudatin+Gefitinib對EGFR及Met相關信號通的影響：與HGF+Gefitinib組比較，HGF+Caudatin+ Gefitinib組顯著降低p-Met、p-PI3K和p-Akt的表達水平(P<0.05)。這提示Caudatin聯合Gefitinib能抑制Met信號通路。

綜上，提示告達庭可能通過抑制Met/PI3K/AKT通路發揮逆轉耐藥效應。

3 討論

吉非替尼是被批準的治療肺癌的二線化療EGFR-TKIs，主要用于己接受過以鉑類為基礎化療的進展期NSCLC患者[11-12]。EGFR基因突變NSCLC患者對EGFR-TKIs的敏感性好，顯示出較好的療效[1,13]。然而，隨著治療時間的延長，初期對EGFR-TKIs治療敏感的EGFR基因突變患者1年后都不可避免地產生獲得性耐藥。

通過對臨床病例的分析發現，對EGFR-TKIs產生獲得性耐藥的有61%患者都出現HGF高表達、T790M突變和Met擴增，其中HGF是一種多功能的細胞因子，不僅會來自腫瘤細胞，間質細胞如成纖維細胞液也會產生。HGF與其受體Met結合后與EGFR信號通路產生交互作用[14]。研究表明，HGF以劑量依賴性的方式使NSCLC細胞對EGFR-TKIs產生獲得性耐藥，主要是因為它通過Met途徑激活了PI3K/AKT通路[7]，因此，要克服HGF誘導的NSCLC細胞對EGFR-TKIs的獲得性耐藥，就需要同時阻斷EGFR 和 HGF-Met信號通路，于是，尋找合適的化合物與EGFR-TKIs聯用來克服NSCLC獲得性耐藥是當前研究的熱點。

從天然產物中尋找活性成分聯合化療可以增效減毒，目前已經在實驗研究和臨床應用中顯示出顯著的療效[15]，告達庭是中藥白首烏(耳葉牛皮消)中的一種C21甾體苷元，研究發現它具有較好的抗腫瘤活性，但目前對于其具體作用機制不是十分明確，本研究結果顯示，告達庭聯合吉非替尼對外源性HGF誘導的PC-9獲得性耐藥有較好的逆轉效應，聯合用藥組抗增殖作用明顯強于各單藥組。通過初步對其機制的研究發現，告達庭能通過抑制Met/PI3K/Akt通路從而恢復NSCLC細胞PC-9對吉非替尼的敏感性。實驗結果顯示，告達庭對EGFR磷酸化水平無明顯影響，但是能抑制Met和 PI3k/Akt磷酸化水平；告達庭與吉非替尼聯合用藥能同時顯著抑制EGFR、HGF-Met 信號通路，提示告達庭可能通過抑制Met/PI3K/AKT通路發揮逆轉耐藥效應。但告達庭這種逆轉耐藥的效應還需要體內實驗和大量的臨床研究進一步予以證實。

總而言之，本研究結果表明，告達庭在體外能逆轉HGF誘導的PC-9細胞對吉非替尼的耐藥，對Met/PI3K/Akt信號通路有顯著抑制，因此告達庭可能會成為有潛力的能克服NSCLC對EGFR-TKIs獲得性耐藥的一種化合物，也符合從天然產物中尋找活性成分聯合現有靶向藥物發揮多靶點協同作用的特點。

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(編校：王儼儼)

Caudatin combined with Gefitinib reversing HGF induced non-small cell lung cancer to EGFR-TKI acquired drug resistance

FAN Fang-tian1, BIAN Qing-ya2, WU Hong-yan2Δ

(1.Department of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine Hanlin College, Taizhou 225300, China; 2.Department of Pharmacy,Yancheng Health Vocational and Technical College, Yancheng 224005, China)

ObjectiveTo investigate the effect and underlying mechanism of Caudatin combined with Gefitinib on Gefitinib resistance induced by HGF in PC-9.MethodsModel of EGFR-TKIs resistance in PC-9 cells was induced by exogenous HGF and co-cultured with MRC-5.Caudatin was tested as a drug resistant modulator to reverse the resistance of Gefitinib in PC-9 cells induced by HGF by MTT assay.Western blot was performed to observe the mechanism of Caudatin combined with Gefitinib reversing the resistance of PC-9 induced by HGF.ResultsThe resistance of gefitinib to PC-9 was induced by exogenous HGF and co-cultured with MRC-5 which could reduce relative inhibitory rate (P< 0.05).Neither caudatin (0-32 μM) or Gefitinib (1 μM) alone could significantly inhibit proliferation of PC-9 in the presence of HGF, which could be inhibited in a dose-dependent manner by Caudatin combined with Gefitinib (P<0.05); Caudatin combined with Gefitinib down-regulated the phosphorylation levels of Met and PI3K/Akt simultaneously (P< 0.05).ConclusionCaudatin could reverse the drug resistance of Gefitinib in PC-9 induced by HGF, the mechanism of which may be related to the inhibition of Met/PI3K/AKT pathway.

non-small cell lung cancer; cell proliferation; Gefitinib; Caudatin

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.14

鹽城市醫學科技發展計劃(YK2014062)；江蘇高校品牌專業建設工程資助項目

范方田，男，碩士，講師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理，E-mail：fftian3912@163.com；吳紅雁，通信作者，男，碩士，講師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理，E-mail：why20133055@163.com。

R453.9

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