高效液相色譜法同時測定發(fā)酵液中木糖醇和L-木酮糖的含量

葛馳宇，蔣潔，翁旭，張君麗

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 淮安 223003； 2.江蘇省蛋白質(zhì)類藥物工程實驗室，江蘇 淮安 223003)

高效液相色譜法同時測定發(fā)酵液中木糖醇和L-木酮糖的含量

葛馳宇1，蔣潔1，翁旭1，張君麗2Δ

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 淮安 223003； 2.江蘇省蛋白質(zhì)類藥物工程實驗室，江蘇 淮安 223003)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)同時測定發(fā)酵液中底物木糖醇和產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖含量的方法。方法 采用C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm)，柱溫35 ℃，以乙腈-水(體積比為85:15)為流動相，流速0.8 mL/min。用示差折光檢測器檢測木糖醇，檢測器溫度為33 ℃。用紫外檢測器在室溫下檢測L-木酮糖，檢測波長為210 nm。結(jié)果 所得木糖醇的線性范圍為0.50～30.00 g/L，相關(guān)系數(shù)為0.9995，最低檢出限為0.18 g/L，最低定量限為0.58 g/L；所得L-木酮糖的線性范圍為0.30～30.00 g/L，相關(guān)系數(shù)為0.9986，最低檢出限0.15 g/L，最低定量限為0.40 g/L；木糖醇的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均分別小于0.64%和 0.80%，L-木酮糖的日內(nèi)和日間RSD均分別小于0.31%和0.59%；回收率均在99.00%～101.00%之間。結(jié)論 建立的HPLC法不受發(fā)酵液中其他組分的干擾，可同時測定底物木糖醇和產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的含量，并實時監(jiān)控發(fā)酵的全過程。

高效液相色譜；同時測定；木糖醇；L-木酮糖；發(fā)酵液

L-木酮糖是一種在多種原核和真核生物代謝途徑發(fā)現(xiàn)的代謝物，是一種稀有糖[1]。口服L-木酮糖可以通過抑制α-葡萄糖苷酶來有效控制餐后血糖升高，此外L-木酮糖用于腫瘤治療時能顯著抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長[2-4]。目前生產(chǎn)L-木酮糖的傳統(tǒng)方法是以D-山梨糖醇為原料的化學(xué)合成法，但該方法合成路線繁瑣，產(chǎn)量很低，且有異構(gòu)體污染[5]。微生物轉(zhuǎn)化法是通過利用菌體靜息細(xì)胞氧化木糖醇生產(chǎn)L-木酮糖，該法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，成本較低且產(chǎn)品純度高[6-7]。目前，以廉價的木糖醇為底物，通過生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-木酮糖，已成為獲取昂貴的稀有糖的重要方法。

發(fā)酵過程中需要建立底物和產(chǎn)物的含量檢測方法來監(jiān)測發(fā)酵的全過程，以便確定發(fā)酵終點。木糖醇屬于多元醇，其檢測方法主要是碘量法[8-9]。在發(fā)酵后期，由于產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的干擾，需要將木糖醇單獨從發(fā)酵液中純化出來進行檢測，分離過程復(fù)雜會導(dǎo)致結(jié)果誤差較大；L-木酮糖主要是半胱氨酸咔唑法和斐林試劑法[7-12]，半胱氨酸咔唑法試劑配制繁瑣，且存在一定的危險性；斐林試劑法屬于滴定分析法，操作繁瑣，容易出現(xiàn)誤差，準(zhǔn)確度不高。此外，劉宇鵬等[13-14]對L-木酮糖的同系物L(fēng)-赤蘚酮糖的含量測定使用了紫外分光光度法，但是該法只有吸光值在 0.3～0.7之間數(shù)據(jù)才準(zhǔn)確可靠，往往發(fā)酵液需要經(jīng)過多次稀釋才能達到該范圍，因此測定過程會產(chǎn)生較大的誤差；對于HPLC法，目前僅有只針對木糖醇或L-木酮糖的含量進行測定的HPLC方法的報道[15-16]。為此，本實驗旨在建立可以同時測定發(fā)酵液中底物木糖醇和產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖的HPLC法。

1 材料與方法

1.1 材料 木醋桿菌(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。

L-木酮糖對照品(HPLC純度為95%)和木糖醇對照品(含量≥99%)均購自美國Sigma公司；乙腈(色譜純，南京化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉均為分析純(英國Oxoid公司)。

分析天平，發(fā)酵罐，Agilent 1260高效液相色譜儀，紫外檢測器和示差折光檢測器(美國Agilent有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient C18(250 mm×4.6 mm)；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈-水(85:15，v/v)；流速：0.8 mL/min。用示差折光檢測器檢測木糖醇，檢測器溫度為33 ℃。用紫外檢測器在室溫下檢測L-木酮糖，檢測波長為210 nm。

1.2.2 供試品溶液的制備：將木醋桿菌接種至30 mL種子液(10 g/L酵母粉，80 g/L葡萄糖)中培養(yǎng)24 h，再按3%的比例接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(30 g/L木糖醇、5 g/L酵母粉、5 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl，pH調(diào)至7.0)中。取發(fā)酵18 h的發(fā)酵液樣品1 mL，4000 r/min離心10 min，收集上清液，用孔徑0.22 μm濾膜過濾，收集濾液用流動相稀釋至1 mL，即為供試品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取木糖醇和L-木酮糖的對照品溶液適量，分別定容于10 mL容量瓶中，用流動相制成濃度為30.00 g/L 的儲備液，再將其分別稀釋成0.00、3.00、6.00、12.00、18.00、24.00、30.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度分別進樣20 μL，測定3次，取峰面積平均值。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。以信噪比(S:N)為3時對照品的濃度為最低檢測限(LOD)，S:N為10時對照品的濃度確定最低定量限(LOQ)。

1.2.4 專屬性考察：在發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液中成分比較復(fù)雜，需要考察這些成分是否會對木糖醇和 L-木酮糖的含量測定產(chǎn)生干擾。為此，分別對空白發(fā)酵培養(yǎng)基(不含木糖醇和L-木酮糖)、木糖醇對照品、L-木酮糖對照品和供試品溶液進行專屬性考察。

1.2.5 精密度實驗：在木糖醇和L-木酮糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍里選擇低、中、高3個質(zhì)量濃度，配制各濃度的對照品溶液樣品。每個濃度樣品分別在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)連續(xù)測定6 次，分別考察每一濃度樣品同一天內(nèi)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，獲得日內(nèi)精密度；分別考察每一濃度樣品不同天之間測定結(jié)果的RSD，獲得日間精密度。

1.2.6 回收率實驗：在木糖醇和L-木酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍里選擇低、中、高3個質(zhì)量濃度，配制各質(zhì)量濃度的對照品溶液樣品，每個濃度樣品配制6份，分別加入空白發(fā)酵培養(yǎng)基，計算每一濃度的加樣平均回收率。

1.2.7 發(fā)酵終點的確認(rèn)：取發(fā)酵0、6、12、18、24、30 h 6個時間點的供試品溶液分別進樣，根據(jù)木糖醇和L-木酮糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算木糖醇和L-木酮糖的含量，并根據(jù)各個時間段木糖醇與L-木酮糖的含量變化趨勢確定發(fā)酵終點。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察結(jié)果 由圖1可見，空白培養(yǎng)基無雜質(zhì)峰出現(xiàn)(a)，示差檢測器均可以檢測到木糖醇對照品(b)與L-木酮糖對照品(c)，供試品溶液在木糖醇與L-木酮糖的保留時間位置處無明顯雜質(zhì)出現(xiàn)(d)；由圖2可見，空白培養(yǎng)基無雜質(zhì)峰出現(xiàn)(a)，紫外檢測器無法檢測到木糖醇對照品(b)，只能檢測到 L-木酮糖對照品(c)，供試品溶液在L-木酮糖保留時間處也無明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn)(d)。表明本文建立的HPLC法木糖醇與L-木酮糖分離度高，且不受發(fā)酵液中其它組分干擾，可用于木糖醇與L-木酮糖的含量測定。

圖1 示差折光檢測器色譜圖a：空白培養(yǎng)基；b：木糖醇對照品溶液；c：L-木酮糖對照品溶液；d：樣品溶液1：溶劑峰；2：L-木酮糖；3：木糖醇Fig.1 Chromatograms detected by refractive index (RI) detector a:blank fermentation broth sample;b:xylitol standard;c:L-xylulose standard;d:fermentation broth sample 1:solvent peak;2:L-xylulose;3:xylitol

圖2 紫外檢測器檢測色譜圖a：空白培養(yǎng)基；b：木糖醇對照品溶液；c：L-木酮糖對照品溶液；d：樣品溶液1：溶劑峰；2：L-木酮糖Fig.2 Chromatograms detected by ultraviolet(UV) detector a:blank fermentation broth sample;b:xylitol standard;c:L-xylulose standard;d:fermentation broth sample 1:solvent peak;2:L-xylulose

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 木糖醇和L-木酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果見表1。

表1 木糖醇和L-木酮糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、

2.3 精密度試驗 取同一份木糖醇對照品溶液，準(zhǔn)確稀釋至5.00、15.00、25.00 g/L 3 個質(zhì)量濃度，按1.2.1色譜條件進行檢測，測得日內(nèi)RSD分別為 0.27%、0.41%、0.64%。測得日間RSD分別為0.32%、0.80%、0.35%。

取同一份L-木酮糖的對照品溶液，準(zhǔn)確稀釋至5.00、15.00、25.00 g/L 3個質(zhì)量濃度，按1.2節(jié)色譜條件進行檢測，測得日內(nèi)RSD分別為0.16%、0.08%、0.31%，測得日間RSD分別為0.28%、0.20%、0.59%。

木糖醇與L-木酮糖的RSD均小于2.00%，符合檢測要求。

2.4 回收率試驗結(jié)果 分別配制5.00、15.00和25.00 g/L的木糖醇和L-木酮糖對照品溶液，加入空白發(fā)酵培養(yǎng)基，回收率結(jié)果見表2。可見高、低、中3個濃度的木糖醇和L-木酮糖的加樣回收率都在99.00%～101.00%之間，符合檢測要求。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖醇與L-木酮糖的回收率

圖3 發(fā)酵過程中木糖醇和L-木酮糖含量的變化情況Fig.3 The content changes between xylitol and L-xylulose in the fermentation broth during the fermentation process

2.5 發(fā)酵終點的確認(rèn) 由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加，底物的含量逐漸減小，產(chǎn)物的含量逐漸增多。當(dāng)發(fā)酵進行到24 h時，約86%的底物木糖醇轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物L(fēng)-木酮糖，約10%左右的木糖醇在發(fā)酵過程中作為木醋桿菌生長的碳源，發(fā)酵24 h與發(fā)酵30 h的產(chǎn)物含量幾乎沒有變化，但與發(fā)酵18 h相比，卻存在顯著性差異，因此判定發(fā)酵24 h為木糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-木酮糖的發(fā)酵終點。

3 討論

木糖醇和L-木酮糖的折光率不同，可以使用示差折光檢測器來進行測定，但木醋桿菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物，且發(fā)酵培養(yǎng)基中除了蛋白胨和酵母粉外，還含有部分雜質(zhì)，這些代謝產(chǎn)物和雜質(zhì)中如果存在結(jié)構(gòu)或保留時間與木糖醇或 L-木酮糖相似的物質(zhì)，單用示差折光檢測器難以發(fā)現(xiàn)。此外，木糖醇屬于糖醇類物質(zhì)，幾乎沒有紫外吸收，因此引入紫外檢測器來提高實驗結(jié)果的可靠性。對L-木酮糖進行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)中的酮基的最大紫外吸收峰在210 nm左右，因此以210 nm作為L-木酮糖的測定波長。

使用HPLC對糖類物質(zhì)進行測定常用的色譜柱是C18柱，流動相是乙腈-水或甲醇-水系統(tǒng)，乙腈和甲醇的紫外吸收峰的截止波長分別在190 nm和205 nm附近，如果使用甲醇作為流動相，其背景吸收較大，會對L-木酮糖測定產(chǎn)生干擾。為此選擇乙腈-水作為流動相。

柱溫太低，會導(dǎo)致色譜柱內(nèi)壓力升高，樣品分離度會變差；柱溫過高，會降低色譜柱的使用壽命。C18色譜柱規(guī)定的最高溫度為50 ℃左右，經(jīng)反復(fù)驗證，本實驗的色譜柱最佳柱溫在35 ℃，可以使流動相黏度變小，提高樣品的溶解度，較好地保證了峰形與分離度。

流速低于0.8 mL/min時，樣品的峰形變寬，保留時間延長，甚至有色譜峰拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，降低測定效率；高于0.8 mL/min時，峰形變窄，保留時間過短，影響對樣品的定量與定性分析。經(jīng)反復(fù)調(diào)整后選擇流速為0.8 mL/min。

本文建立的方法可以同時測定發(fā)酵液中的L-木酮糖與殘余木糖醇的含量，分辨率高、線性范圍廣，且發(fā)酵液中的其它組分對這2種物質(zhì)的測定均不產(chǎn)生影響，可以實時反映木糖醇發(fā)酵生產(chǎn)L-木酮糖的全過程，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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(編校：吳茜)

Simultaneous determination of xylitol and L-xylulose in fermentation broth with high performance liquid chromatography

GE Chi-yu1, JIANG Jie1, WENG Xu1, ZHANG Jun-li2Δ

(1.School of Pharmacy, Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College, Huai’an 223003, China;2.Jiangsu Protein Drug Engineering Laboratory, Huai’an 223003, China)

ObjectiveA high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the simultaneous determination of xylitol and L-xylulose in fermentation broth.MethodsThe chromatographic conditions were as follows：C18 column (250 mm×4.6 mm) with the temperature 35 ℃, acetonitrile-water (85:15，v/v)as mobile phase with the flow rate of 0.8 mL/min.Xylitol was detected by refractive index (RI) detector at 33 ℃ and L-xylulose was determined by ultraviolet (UV) detector at 210 nm at room temperature.ResultsThis method showed good linearity over the range from 0.50～30.00 g/L with a correlation coefficient of 0.9995 for xylitol and 0.30～30.00 g/L with a correlation coefficient of 0.9986 for L-xylulose. Moreover, the limit of quantification (LOQ) for xylitol and L-xylulose were 0.58 and 0.40，respectively.The limit of determination (LOD) for xylitol and L-xylulose were 0.18 and 0.15，respectively.The relative standard deviations (RSDs) of intraday and interday for xylitol were less than 0.64%and 0.80%，respectively.The intraday and interday RSDs for L-xylulose were less than 0.31%and 0.59%.The recoveries of xylitol and L-xylulose in fermentation broth were between 99.00%-101.00%.ConclusionThere was no interference from other constitutes in the fermentation broth by this method.The methods were suitable for the simultaneous determination of the substrate xylitol and the product L-xylulose in fermentation process.

high performance liquid chromatographic (HPLC); simultaneous determination; xylitol; L-xylulose; fermentation broth

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.58

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201513104018X)

葛馳宇，男，博士，工程師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：gechiyu2002@163.com；通信作者，張君麗，女，工程師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：junli0009@163.com。

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