聯合檢測FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質不同病變中的意義*

冼 晶,梁秀就,黃高明,李 勵,蔡勁薇,黃 松,盧德成,羅佐杰△

(廣西醫科大學：1.第一附屬醫院內分泌科；2.第一附屬醫院病理科；3.公共衛生學院流行病學與統計學教研室，廣西南寧 530021)

·論 著·

聯合檢測FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質不同病變中的意義*

冼 晶1,梁秀就2,黃高明3,李 勵1,蔡勁薇1,黃 松1,盧德成1,羅佐杰1△

(廣西醫科大學：1.第一附屬醫院內分泌科；2.第一附屬醫院病理科；3.公共衛生學院流行病學與統計學教研室，廣西南寧 530021)

目的 探討皮質醇增多癥腎上腺皮質不同病變中脆性組氨酸三聯體(FHIT)、Ki-67及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達水平及其在鑒別診斷中的作用。方法 應用免疫組織化學方法檢測49例皮質醇增多癥腎上腺皮質病變(腺癌14例、腺瘤26例、皮質增生9例)患者FHIT、Ki-67及PCNA的表達。結果 FHIT在腎上腺皮質增生表達最高，腺瘤次之，腺癌最低(分別為100.00%、96.15%、42.86%)；Ki-67與PCNA在腎上腺皮質腺癌的表達最高，腺瘤次之，皮質增生最低(分別為85.71%、7.69%、0和100.00%、96.15%、77.78%)。FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中的表達兩兩相關，其中FHIT與Ki-67表達呈負相關(r=-0.718，P=0.00)，FHIT與PCNA表達呈負相關(r=-0.449，P=0.001)，Ki-67與PCNA表達呈正相關(r=0.387，P=0.006)。聯合檢測FHIT、Ki67及PCNA結果顯示，腺癌表現為FHIT陰性或弱陽性、Ki-67強陽性、PCNA強陽性；腺瘤表現為FHIT陽性、Ki-67陽性、PCNA陽性；皮質增生表現為FHIT強陽性、Ki-67陰性、PCNA陰性。結論 聯合檢測FHIT、Ki-67及PCNA對腎上腺皮質腺癌、腺瘤及增生的鑒別診斷具有重要的價值。

皮質醇增多癥；脆性組氨酸三聯體；Ki-67；增殖細胞核抗原；聯合檢測

脆性組氨酸三聯體(fragile histindine triad，FHIT)是一種腫瘤抑制基因，其蛋白表達的缺失與多種腫瘤的發生和發展密切相關[1]。腫瘤增殖抗原Ki-67，是一種存在于增殖細胞核的非組蛋白性核蛋白，與細胞增殖密切相關[2]。增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，是一種僅在增殖細胞中合成或表達的核內多肽，其表達與合成與細胞周期有關，是判斷各種惡性腫瘤細胞增殖及其惡性度的一種指標[3]。FHIT、Ki-67及PCNA為目前用于多種人類腫瘤發生、發展中的研究，但其在內分泌病變中的表達及和內分泌腫瘤的發生、發展的關系研究較少，亦少見三者聯合檢測用于腎上腺皮質腺瘤、腺癌及皮質增生鑒別診斷的報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織標本為廣西醫科大學第一附屬醫院2005～2012年手術切除、經病理證實的皮質醇增多癥腎上腺皮質病變石蠟包埋標本49份，其中腎上腺皮質腺癌14份，腺瘤26份，增生9份[均為不依賴垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)的雙側腎上腺小結節性增生]。其中，男19例，女30例；年齡5～68歲，平均(35.84±16.18)歲。患者均有皮質醇增多癥典型的臨床癥狀、體征和實驗室改變，行小劑量地塞米松抑制試驗均不被抑制，臨床確診為皮質醇增多癥。研究獲得本單位倫理委員會的審查批準及受試者簽署的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 兔抗人FHIT濃縮型多克隆抗體購自北京中山生物技術公司，鼠抗人Ki-67、PCNA單克隆抗體和EliVision 檢測試劑盒為福州邁新生物技術公司產品。采用EliVision二步法，參照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。主要染色步驟：切片脫蠟和水化后抗原修復，一抗FHIT(工作濃度1∶100)、Ki-67(即用型)、PCNA(即用型)37 ℃孵育60 min，然后滴加放大劑、多聚酶結合物，DAB顯色，復染等。

1.2.2 結果判斷 細胞核或細胞質呈棕褐色或棕黃色顆粒者為陽性細胞。FHIT蛋白定位于細胞質。Ki-67、PCNA陽性定位于細胞核。按染色強度評分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞所占的百分比評分：陽性細胞小于5%為0分，≥5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩者的乘積：0分為陰性(-)，1～<5分為弱陽性(+)，5～<9分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。 Ki-67陽性定位于細胞核，陽性細胞數小于10%為陰性(-)，陽性細胞數大于或等于10%為陽性：其中10%～25%為弱陽性(+)，>25%～50%為中等陽性(++)，>50%為強陽性(+++)[4]。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計學分析，總陽性率比較采用χ2檢驗，如有實際數為零或不滿足χ2檢驗條件，改用Fisher確切概率法；各指標間相關分析采用Spearman秩相關。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67及PCNA的表達

2.1.1 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中FHIT的表達 腺癌的總陽性率均較腺瘤及增生低(χ2=16.272，P=0.000)。腺瘤與增生在總陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，在分級比較中，增生的表達全部為強陽性，腺瘤中16例為中陽性表達(61.54%)，有9例為強陽性表達(34.62%)。腺癌僅6例表現為弱陽性(42.86%)，其余全部為陰性。腺癌在陰性及弱陽性(-/+)的表達較腺瘤及增生高，見表1、圖1。

2.1.2 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中Ki-67的表達 腺癌Ki-67總陽性率的表達較腺瘤及增生高(χ2=29.187，P=0.000)，腺瘤與增生Ki-67總陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。在分級比較中，增生的表達全部為陰性，腺瘤有2例為弱陽性表達(7.69%)。腺癌在較高陽性(++/+++)的表達比腺瘤及增生高，見表2、圖1。

2.1.3 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中PCNA的表達 腺瘤、腺癌、增生三者的總陽性率在兩兩比較差異無統計學意義(χ2=3.794，P=0.147)。但在分級比較中，腺癌在較高陽性(++/+++)的表達較腺瘤、增生高，腺瘤、增生的表達多為陰性及弱陽性，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖1。

表1 FHIT在皮質醇增多癥腎上腺病變中的表達[n(%)]

a：P<0.05，與腺癌比較。

表2 Ki-67在皮質醇增多癥腎上腺病變中的表達[n(%)]

a：P<0.05，與腺癌比較。

表3 PCNA在皮質醇增多癥腎上腺病變中的表達[n(%)]

a：P<0.05;與增生比較；b：P<0.01，與腺癌比較。

FHIT：腺癌陰性表達，腺瘤中等陽性，增生強陽性；Ki-67：腺癌強陽性，腺瘤弱陽性，增生陰性；PCNA：腺癌強陽性，腺瘤中等陽性，增生陰性 (箭頭示陽性反應部位，免疫組化EliVisionTMsuper二步法，×400)。

圖1 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67及PCNA的表達

2.2 皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中FHIT、Ki-67及PCNA表達的關系 FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中的表達兩兩相關，其中FHIT與Ki-67表達呈負相關(r=-0.718，P=0.000)，FHIT與PCNA表達呈負相關(r=-0.449，P=0.001)，Ki-67與PCNA表達呈正相關(r=0.387，P=0.006)，見表4～6。

表4 腎上腺皮質病變中FHIT與Ki-67表達的關系

2.3 聯合檢測FHIT、Ki67及PCNA結果 腺癌表現為FHIT陰性或弱陽性、Ki-67強陽性、PCNA強陽性；腺瘤表現為FHIT陽性、Ki-67陽性、PCNA陽性；增生表現為FHIT強陽性、Ki-67陰性、PCNA陰性。

表5 腎上腺皮質病變中FHIT與PCNA表達的關系

表6 腎上腺皮質病變中Ki-67與PCNA表達的關系

3 討 論

皮質醇增多癥腎上腺皮質病變的診斷包括定性診斷與病因診斷，在目前條件下，定性診斷一般不困難，但在病因診斷時不少病例在臨床和病理上均不易明確區分，以致誤診及治療方案選擇困難。

FHIT基因異常與人類多種惡性腫瘤的發生、發展有關[1]。FHIT基因編碼的蛋白質為FHIT蛋白，具有抑癌活性[5]，在多種環境致癌物相關惡性腫瘤的發生中起重要作用[6]。在各種致癌因素影響下， 其表達受阻可使FHIT蛋白表達降低，惡性病變組織中檢測到FHIT蛋白低表達或缺失，相反FHIT蛋白的高表達提示為良性。在多種人類腫瘤中可發現FHIT蛋白表達的缺失，其缺失的程度與其良、惡性及預后有關[7-9]。本研究發現在皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中，FHIT在腺癌的表達率最低，且全部為陰性或弱陽性，增生的表達率最高，且全部為強陽性，腺瘤的表達介于二者之間，提示FHIT基因轉錄產物異常及其蛋白表達的改變與腎上腺皮質病變的良、惡性有密切關系，腺癌較腺瘤和增生更為明顯，其表達下調可能促進腫瘤的進展。另外發現FHIT在腎上腺皮質腺癌中除有57.14%(8/14)為陰性表達外，另有42.86%(6/14)為弱陽性表達，提示FHIT基因編碼的蛋白質在惡性腫瘤中亦非全部缺失，部分僅為蛋白表達的減少，FHIT在腎上腺皮質腺癌中的部分低表達與此有關，其原因推測可能與腫瘤的惡性程度有關，部分腺癌的惡性程度較高，則FHIT蛋白的表達顯示為缺失，而另一部分腺癌惡性程度較低，FHIT蛋白可部分表達。

Ki-67表達能可靠而迅速地反映惡性腫瘤增殖率，與多種腫瘤的發展、轉移、預后有關，Ki-67高表達提示腫瘤的惡性程度較高，預示較差的預后[10-12]。Ki-67在腎上腺腫瘤的表達對皮質醇增多癥腎上腺皮質病變的鑒別診斷有重要意義，但文獻甚少這方面的報道。本研究發現皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中，Ki-67在腺癌的表達率最高，腺瘤較低，增生則不表達，提示皮質腺癌的細胞增殖較腺瘤和增生更為活躍，Ki-67的表達隨增生、腺瘤、腺癌的細胞增殖程度的提高，表達的陽性強度增加，陽性率亦有增加。由于腫瘤的惡性程度與腫瘤細胞增殖分裂的程度密切相關，因此Ki-67表達的高低可反映腫瘤的惡性程度的高低[13]。

細胞過度增殖可能導致腫瘤的發生，而增殖是腫瘤浸潤和轉移的基礎，因此腫瘤細胞增殖水平可反映腫瘤的惡性程度。PCNA是DNA合成必需的細胞周期蛋白，又僅在增殖細胞中表達，其在腫瘤細胞中的表達情況可以敏感地反映腫瘤細胞的增殖活性[3,14-15]。 較高的PCNA表達率反映了高水平的細胞增殖狀態[16]。本研究發現在皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中，PCNA的表達在腺癌最高，腺瘤次之，增生最低。由于從增生、腺瘤到腺癌，細胞增殖水平的提高，PCNA表達的陽性強度亦隨之增加。且由于增生和腺瘤的細胞增殖水平不同，PCNA表達高低也可以作為二者的判斷指標。

FHIT基因蛋白具有抑癌活性， Ki-67和PCNA能反映細胞的增殖狀況。本研究結果顯示，FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質病變中的表達兩兩相關。其中，FHIT與Ki-67表達呈負相關，即隨著細胞增殖程度的不同，腫瘤抑制基因FHIT表達越高，Ki-67表達則越低，反之亦然。FHIT與PCNA表達呈負相關，即FHIT表達越高，PCNA表達則越低，反之亦然。而Ki-67與PCNA表達呈正相關，即隨著細胞增殖程度的增加，腫瘤增殖抗原Ki-67表達升高，同時增殖細胞核抗原PCNA表達也升高，反之，Ki-67降低， PCNA也降低。

本研究發現 FHIT、Ki-67及PCNA在皮質醇增多癥腎上腺皮質腺癌、腺瘤及增生的表達有一定的規律，FHIT陰性或弱陽性、Ki-67強陽性、PCNA強陽性的腎上腺皮質病變為腺癌；FHIT強陽性、 Ki-67陰性、PCNA陰性或弱陽性的腎上腺皮質病變為增生；而腎上腺皮質腺瘤介于腺癌和增生之間，FHIT陽性、Ki-67陽性、PCNA陽性的腎上腺皮質病變為腺瘤。因此，聯合檢測FHIT、Ki-67及PCNA對腎上腺皮質腺癌、腺瘤及增生的鑒別診斷具有重要的價值。根據FHIT、Ki-67及PCNA的不同表達結果，能對皮質腺癌、腺瘤及增生作出鑒別，FHIT、Ki-67及PCNA可作為皮質醇增多癥腎上腺皮質病變鑒別診斷的較可靠的標記物。

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Significance of combined detection of FHIT,Ki-67 and PCNA among different adrenocortical diseases in hypercortisolism*

XianJing1,LiangXiujiu2,HuangGaoming3,LiLi1,CaiJingwei1,HuangSong1,LuDecheng1,LuoZuojie1△

(1.DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity;2.DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity;3.DepartmentofEpidmiologyandStatistics,PublicHealthCollegeofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To study the expression of fragile histindine triad(FHIT),Ki-67 and proliferation cell nuclear antigen(PCNA) among different adrenocortical diseases in hypercortisolism and their role in the differential diagnosis.Methods The expressions of FHIT,Ki-67 and PCNA were detected by immunohistochemical staining in 49 cases of adrenocortical diseases,including 14 cases of adrenocortical adenocarcinoma,26 cases of adrenocortical adenoma and 9 cases of adrenocortical hyperplasia.Results The expression rate of FHIT in adrenocortical hyperplasia was highest,followed by adrenocortical adenoma and which in adrenocortical adenocarcinoma was lowest(100.00%,96.15% and 42.86%).The expression rate of Ki-67 in adrenocortical adenocarcinoma and adrenocortical adenoma was 85.71% and 7.69% respectively,while there was no expression at all in adrenocortical hyperplasia(0).The expression rate of PCNA in adrenocortical adenocarcinoma,adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperplasia was 100.00%,96.15% and 77.78%,respectively.The expression of FHIT,Ki-67 and PCNA in adrenocortical diseases of hypercortisolism was pairwise correlated,in which the FHIT expression was negatively correlated with the Ki-67 expression (r=-0.718,P=0.00) and the FHIT expression was negatively correlated with the PCNA expression (r=-0.449,P=0.001),while the Ki-67 expression was positively correlated with the PCNA expression(r=0.387,P=0.006).The combined detect of FHIT,Ki-67 and PCNA expressions indicated that adrenocortical adenocarcinoma showed negative or weak positive FHIT,strongly positive Ki-67 and PCNA;adrenocortical adenoma was manifested by positive FHIT,Ki-67 and PCNA;adrenocortical hyperplasia was manifested by strong positive FHIT,negative Ki-67 and PCNA.Conclusion The combined detection of FHIT,Ki-67 and PCNA has an important value for the differential diagnosis of adrenocortical adenocarcinoma,adrenocortical adenoma and adrenocortical hyperplasia.

hypercortisolism;fragile histindine triad;Ki-67;proliferation cell nuclear antigen;combined detect

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.002

國家自然科學基金資助項目(81060220)；廣西自然科學基金資助項目(2011GXNSFA018172)；廣西留學回國人員科學基金資助項目(桂科回0731019)；廣西青年科學基金資助項目(桂科青0728073)；廣西衛生廳自籌經費科研課題資助項目(Z2013027)。 作者簡介：冼晶(1979-)，主治醫師，碩士研究生，主要從事內分泌腎上腺疾病診治研究。△

，Tel:13607862298；E-mail:zluo888@163.com。

R586.2

A

1671-8348(2016)05-0580-04

2015-08-20

2015-10-14)