大鼠伏核注射甘丙肽對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響*

張?bào)忝?李崇陽(yáng),趙 敏，李 君，徐世蓮△

(昆明醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，昆明 650500；2.第四附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650021；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，昆明 650500)

·論 著·

大鼠伏核注射甘丙肽對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響*

張?bào)忝?,李崇陽(yáng)2#,趙 敏3，李 君1，徐世蓮1△

(昆明醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，昆明 650500；2.第四附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650021；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，昆明 650500)

目的 探討神經(jīng)病理性痛大鼠伏核注射甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。方法 左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎構(gòu)建神經(jīng)病理性痛大鼠模型，伏核注射甘丙肽，測(cè)定傷害性熱刺激和壓力刺激誘發(fā)的后爪縮爪潛伏期(HWL)，觀察甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用；Western bolt法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物-膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，觀察伏核注射甘丙肽對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。結(jié)果 左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起大鼠雙側(cè)HWL縮短，且伏核GFAP的表達(dá)增加；神經(jīng)病理性痛大鼠伏核注射甘丙肽引起雙側(cè)HWL延長(zhǎng)，GFAP的表達(dá)減少。結(jié)論 伏核微量注射甘丙肽對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用可能通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)完成。

甘丙肽；伏核；星形膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)病理性痛；鎮(zhèn)痛作用

在臨床，由疾病和損傷引起的慢性疼痛已經(jīng)成為影響健康的一個(gè)主要問(wèn)題，而神經(jīng)病理性痛是慢性疼痛中最為常見(jiàn)的一種。以往對(duì)疼痛的形成機(jī)制及其鎮(zhèn)痛的研究多集中在神經(jīng)元的作用上，但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞(glial cells)參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，這其中就包括了疼痛[1]。在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間存在著相互協(xié)作的關(guān)系，致使疼痛發(fā)生，且愈演愈烈[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)伏核(nucleus accumbens,NAc)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes)的特異性標(biāo)志物-膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)，進(jìn)一步探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生和調(diào)制中的作用。 甘丙肽(galanin)是一種29 aa(在人類(lèi)中為30 aa)的多肽，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周組織中，是一種以抑制性作用為主的神經(jīng)肽[3-4]。1994年瑞典Hokfelt等[5]提出甘丙肽可能具有鎮(zhèn)痛作用，是一種內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)。本課題前期研究也表明在正常大鼠和炎癥大鼠的伏核注射甘丙肽具有鎮(zhèn)痛作用[6-7]。但甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制不清，目前多認(rèn)為甘丙肽通過(guò)激活其受體來(lái)完成作用[8]。伏核是一個(gè)重要的中樞鎮(zhèn)痛部位。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道伏核在痛覺(jué)信息的產(chǎn)生和調(diào)制中具有重要作用[9-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究大鼠伏核注射甘丙肽對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，探索甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用是否通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)完成。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)選用雄性Sprague-Dawky大鼠40只，體質(zhì)量180～250 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由取食和飲水，自然光照。實(shí)驗(yàn)采取各種措施以減小對(duì)動(dòng)物的傷害，所有操作均符合國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)(international association for the study of pain,IASP)[12]和昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。(2)實(shí)驗(yàn)藥品：實(shí)驗(yàn)所用微量注射溶液均用生理鹽水配制，0.5 nmol/L的甘丙肽(rat甘丙肽,Tocris,UK)。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)量后爪縮爪潛伏期(hindpaw withdrawal latency,HWL) 實(shí)驗(yàn)使用熱板智能儀(YLS-6B，濟(jì)南益延科技有限公司) 測(cè)試熱刺激誘發(fā)的HWL，溫度維持在(52.0±0.2)℃[13-14]。將大鼠一側(cè)后爪足底平放于熱板，并保證大鼠整個(gè)足底充分接觸熱板，大鼠縮爪時(shí)間即為熱刺激誘發(fā)的HWL。使用Randall Selitto(UGO Basile 37215，意大利)測(cè)試壓力刺激誘發(fā)的HWL。 Randall Selitto的楔形壓力閥壓在鼠爪的爪背靠近腳趾處，踩住開(kāi)關(guān)，步進(jìn)馬達(dá)推動(dòng)砝碼向前移動(dòng)，此時(shí)施加在大鼠后爪上的壓力以30 g/s的速度增加，讀出大鼠后爪回縮時(shí)砝碼所指的刻度，即為壓力刺激誘發(fā)的HWL。實(shí)驗(yàn)前大鼠需進(jìn)行5 d熱板和Randall Selitto測(cè)試的訓(xùn)練,以使動(dòng)物對(duì)傷害性刺激的HWL較為平穩(wěn),維持在3～6 s。

1.2.2 Western blot檢測(cè)伏核GFAP的表達(dá) 將大鼠用4%異氟醚麻醉后斷頭取腦，提取伏核部位蛋白質(zhì)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，Western blot法檢測(cè)GFAP的表達(dá)。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后將膜以5%脫脂奶粉封閉1 h，加入洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)稀釋的多克隆GFAP抗體 (小鼠抗GFAP，1∶5 000，Millipore) 或者單克隆GAPDH抗體(小鼠抗GAPDH，1∶5 000,Millipore)，4 ℃過(guò)夜 。 棄一抗，以 TBST洗滌3次，每次10 min。 加入TBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(horse reddish peroxidase,HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶4 000，Pierce)中，室溫孵育1 h。棄二抗，以TBST洗滌3次，每次10 min。顯影和定影，用image J 軟件分析條帶。

1.2.3 神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型建立 將14只大鼠分為假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)結(jié)扎組，每組7只。兩組大鼠均采用腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，在其左側(cè)大腿中部暴露約8～10 mm長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)；坐骨神經(jīng)結(jié)扎組使用4號(hào)羊腸線輕度結(jié)扎神經(jīng)，共結(jié)扎4圈，最后用4號(hào)絲線縫合皮膚[15]；假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)后即縫合皮膚，不做神經(jīng)結(jié)扎。術(shù)后14 d測(cè)定大鼠對(duì)傷害性熱刺激和壓力刺激誘發(fā)的HWL，并檢測(cè)伏核GFAP的表達(dá)。

1.2.4 伏核埋管和微量注射方法 用45 mg/kg的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，進(jìn)行伏核內(nèi)埋管[16]。將外徑為0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入，使用牙科水泥將套管牢固固定。實(shí)驗(yàn)時(shí)用外徑為0.4 mm的不銹鋼管作注射管，注射時(shí)其尖端伸出套管1 mm，以1 μL/min的速度均勻推進(jìn)1 μL的藥物。

1.2.5 檢測(cè)左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠伏核注射甘丙肽對(duì)HWL和GFAP表達(dá)的影響 將26只大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎14 d后，分為生理鹽水注射組(對(duì)照組)和0.5 nmol 甘丙肽注射組(甘丙肽組)，每組13只，測(cè)定對(duì)照組或甘丙肽組第1、3、5天大鼠雙側(cè)HWL的變化，每次測(cè)定都在注射后15 min開(kāi)始。行為學(xué)測(cè)定后迅速取伏核組織，檢測(cè)GFAP的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)結(jié)扎組大鼠HWL和伏核GFAP表達(dá)的比較 與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)結(jié)扎組大鼠雙側(cè)HWL 縮短(熱板測(cè)試:t左側(cè)=10.91,P=0.000 1;t右側(cè)=4.37,P=0.000 9。Randall Selitto測(cè)試:t左側(cè)=5.87,P=0.000 1;t右側(cè)=4.72,P=0.000 5)，見(jiàn)圖1。兩組大鼠行為學(xué)測(cè)定后取伏核組織蛋白質(zhì)，Western blot法測(cè)定GFAP的表達(dá)，與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)結(jié)扎組GFAP的表達(dá)上調(diào) (t=3.47,P=0.013),見(jiàn)圖2。

a：P<0.01，與假手術(shù)組比較。

圖1 假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)結(jié)扎組大鼠HWL的比較

a：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

圖2 假手術(shù)組和神經(jīng)結(jié)扎組大鼠伏核GFAP的表達(dá)

表1 對(duì)照組與甘丙肽組大鼠對(duì)熱刺激引起的 HWL比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.2 對(duì)照組與甘丙肽組大鼠HWL和GFAP表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，甘丙肽組注射第1天(熱板測(cè)試:t左側(cè)=2.27、P=0.032 1,t右側(cè)=3.45、P=0.002 1；Randall Selitto測(cè)試:t左側(cè)=2.74、P=0.011 3，t右側(cè)=4.43、P=0.000 2)、第3天(熱板測(cè)試:t左側(cè)=4.31、P=0.000 4，t右側(cè)=7.08、P=0.000 1；Randall Selitto測(cè)試:t左側(cè)=2.81、P=0.012 0，t右側(cè)=4.17、P=0.000 6)、第5天(熱板測(cè)試:t左側(cè)=4.84、P=0.000 4，t右側(cè)=3.23、P=0.007 2；Randall Selitto測(cè)試:t左側(cè)=4.61、P=0.000 6，t右側(cè)=4.52、P=0.000 7)HWL都延長(zhǎng)(表1、2)。各組行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，取伏核組織蛋白質(zhì)，Western blot檢測(cè)注射甘丙肽第1、3、5天伏核GFAP的表達(dá)。與對(duì)照組比較，甘丙肽組第1天GFAP的表達(dá)(t=2.36,P=0.142 5)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但甘丙肽組第3天(t=2.93,P=0.042 9)和第5天(t=5.84,P=0.004 3)GFAP的表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖3。

表2 對(duì)照組與甘丙肽組大鼠對(duì)壓力刺激引起的 HWL比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖3 對(duì)照組與甘丙肽組大鼠GFAP表達(dá)比較(n=3)

3 討 論

雖然病理性神經(jīng)痛是臨床最常見(jiàn)的慢性疼痛之一，但因其產(chǎn)生機(jī)制不完全清楚，故仍缺乏有效的治療措施。Bennett等[15]在1988年描述了結(jié)扎一側(cè)坐骨神經(jīng)干的動(dòng)物模型，是目前公認(rèn)的一種造成外周神經(jīng)損傷、導(dǎo)致神經(jīng)痛的一種常用方法。坐骨神經(jīng)干結(jié)扎后，神經(jīng)水腫引起血液供應(yīng)障礙和外周軸突損傷，包括有髓神經(jīng)纖維和無(wú)髓神經(jīng)纖維，尤其是有髓神經(jīng)纖維。結(jié)扎7～10 d后出現(xiàn)疼痛綜合征，其特點(diǎn)是對(duì)熱刺激和壓力刺激的痛敏或觸摸痛，痛敏高峰在14～28 d[15]。本實(shí)驗(yàn)研究觀察到大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎后14 d引起雙側(cè)HWL縮短，大鼠痛閾降低，產(chǎn)生神經(jīng)痛。

近年來(lái)，有關(guān)膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺(jué)信息的調(diào)制中的作用的研究日漸增多。先前的研究報(bào)道脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在炎癥痛[17-18]和神經(jīng)痛[19-20]的產(chǎn)生和維持中都具有重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞一旦被激活，便可釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)，包括白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、前列腺素、興奮性氨基酸、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，這些物質(zhì)通過(guò)提高初級(jí)傳入神經(jīng)釋放P物質(zhì)、興奮性氨基酸和增加產(chǎn)生疼痛物質(zhì)的神經(jīng)元的興奮性來(lái)調(diào)節(jié)疼痛[21]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白[22]，本實(shí)驗(yàn)研究顯示左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起大鼠伏核GFAP的表達(dá)上調(diào)，也提示伏核星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化在神經(jīng)痛的產(chǎn)生和維持中具有重要作用。

自從1983年Tatemoto 等[23]從豬的小腸中分離提取了甘丙肽，越來(lái)越多的研究表明甘丙肽在痛覺(jué)信息的傳遞和調(diào)制中具有重要作用。有研究報(bào)道坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)注射甘丙肽有鎮(zhèn)痛作用[24]。Gu等[25]報(bào)道坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠下丘腦弓狀核注射甘丙肽有鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠伏核注射甘丙肽15 min后引起雙側(cè)HWL延長(zhǎng)，提示甘丙肽在伏核對(duì)神經(jīng)痛具有鎮(zhèn)痛作用。

盡管研究表明甘丙肽具有鎮(zhèn)痛作用，但其作用機(jī)制并不十分清楚，先前的研究表明甘丙肽受體的非選擇性拮抗劑galantide能阻斷甘丙肽的作用，提示甘丙肽受體的激活在甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用中具有重要作用[6,24,26]。有研究報(bào)道體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞有甘丙肽受體的表達(dá)[27]，在體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)中甘丙肽具有轉(zhuǎn)錄激活因子的作用[28]，這些結(jié)果提示甘丙肽和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間具有密切的聯(lián)系。因此，本實(shí)驗(yàn)研究甘丙肽是否通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)完成鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠伏核注射甘丙肽第1天GFAP的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但注射甘丙肽第3、5天GFAP的表達(dá)下調(diào)，提示甘丙肽可能通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，但星形膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺(jué)調(diào)制的作用可能是延遲性的[29]。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究顯示坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)痛大鼠伏核星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活；甘丙肽在伏核對(duì)神經(jīng)痛具有鎮(zhèn)痛作用，且這一作用的產(chǎn)生可能涉及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化被抑制。這些結(jié)果提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化在病理性神經(jīng)痛的產(chǎn)生和維持中有重要作用，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能是治療神經(jīng)痛的有效措施。但對(duì)于這些變化的生理意義以及星形膠質(zhì)細(xì)胞如何參與疼痛的調(diào)制等都需要進(jìn)一步深入的研究。

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Analgesic effects of nucleus accumbens injection of galanin in rats with neuropathic pain and its influence on astrocyte activation*

ZhangXiaomin1,LiChongyang2#,ZhaoMin3,LiJun1,XuShilian1△

(1.DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China;2.DepartmentofOncology,FourthAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China;3.DepartmentofAnatomyandHistoembryology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China)

Objective To research the analgesic effect of nucleus accumbens (NAc) injection of galanin in rats with neuropathic pain and its influence on astrocyte activation.Methods The rat left sciatic nerve was ligated for constructing the neuropathic pain rat model.Galanin was injected by intra-NAc.The rat hindpaw withdrawal latency (HWL) induced by the damaging thermal and pressure stimuli was determined for researching the analgesic effect of galanin;the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) as the astrocyte specific marker was detected by Western blot.The influence of NAc injection on the astrocyte activation was investigated.Results The bilateral HWL induced by the left sciatic nerve ligation was shortened,moreover the GFAP expression in NAc was upregulated;the intra-NAc injection of galanin induced an increase in bilateral HWL and a downregulation of GFAP expression.Conclusion The NAc microinjection of galanin may play the analgesic role on neuropathic pain via inhibiting the astrocyte activation.

galanin;nucleus accumbens;astrocytes;neuropathic pain;analgesic role

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360245，31460258)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目基金(2011FZ111)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合資金項(xiàng)目(2015FB012)。 作者簡(jiǎn)介：張?bào)忝?1984-)，講師，博士研究生，主要從事生理學(xué)科研與教學(xué)工作。 # 共同第一作者：李崇陽(yáng)(1968-)，主治醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事腫瘤學(xué)的研究。△

，Tel:15887826597；E-mail:shilianxu@126.com。

R338.3

A

1671-8348(2016)05-0584-04

2015-08-13

2015-10-24)