pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內表達的實驗性研究*

肖 歡，潘衛民，王超群，陳鴻顏，徐軍發

(1.海南醫學院附屬醫院核醫學教研室，海南海口 570102；2.海南醫學院附屬醫院核醫學科，海南海口 570102；3.廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808)

論著·基礎研究

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內表達的實驗性研究*

肖 歡1,2，潘衛民1,2，王超群2，陳鴻顏2，徐軍發3

(1.海南醫學院附屬醫院核醫學教研室，海南海口 570102；2.海南醫學院附屬醫院核醫學科，海南海口 570102；3.廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808)

目的 獲得重組pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝內的高效穩定表達。方法 采用流體動力法將表達mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表達載體輸注小鼠體內，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)和實時定量PCR(RT-PCR)的方法，定量檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體的內表達。結果 經尾靜脈注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝組織中穩定表達，在48 h時間點分泌的量達到最高，最大量約120 ng/mL。結論 成功將pcDNA3.1/mB7-H4-Fc表達載體導入了小鼠肝臟，并獲得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝內的高效穩定表達。

B7-H4；pcDNA3.1/mB7-H4-Fc；流體動力學

B7-H4[1]分子自發現以來一直被公認為是T細胞活化一個強有力的負性調控因子。在機體的免疫應答過程中，B7-H4分子為免疫細胞的激活提供了刺激信號。活化的T細胞產生以白細胞介素(IL)-10[2]、IL-2[3]、IL-12[4]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]、γ-干擾素(IFN-γ)[6]為主的細胞因子。而IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子介導的肝細胞免疫性損傷正是病毒性肝炎的重要致病機制。本研究通過流體動力法將重組pcDNA3.1/mB7-H4-Fc 表達載體導入小鼠體內，采用實時定量PCR(RT-PCR)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測mB7-H4-hIg在體內的表達水平和表達持續時間。為進一步研究可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白對Con A誘導肝損傷的保護作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)主要實驗材料：真核表達質粒(pcDNA3.1/mB7-H4-hIg)[7]由廣東醫學院臨床免疫學教研室贈送；DH5a宿主菌為本室保存；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG二抗、羊抗人IgG多克隆抗體、HRP標記抗人IgG單抗和羊抗人IgG-HRP購自北京中山生物技術有限公司；TRIzol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自美國Gibco公司；質粒小量提取試劑盒和無內毒素質粒大提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自美國NEB公司。(2)實驗動物：KM小鼠54只，8～10周齡，體質量18～22 g，雌雄各半，由海南醫學院動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 KM小鼠由本院實驗動物中心常規飼養，整個實驗過程自由攝食及飲水。根據注射成分不同分成3組，即注射空載體pcDNA3.1組(A組)、注射表達載體pcDNA3.1/mB7-H4-hIg組(B組)、空白對照組(C組)。將B組小鼠按照時間，共分成6個組，即8 h組(1組)，24 h組(2組)，48 h組(3組)，72 h組(4組)，96 h組(5組)及120 h組(6組)。

1.2.2 pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內的表達 按去內毒素大提質粒試劑盒說明書提取質粒，將分別攜帶pcDNA3.1/mB7-H4-hIg重組質粒和pcDNA3.1空載體的DH5a宿主菌分別接種于500 mL Amp+ LB培養基，增菌至飽和狀態。收集菌體，并提取質粒，紫外吸光度法鑒定備用。參照Liu等[8]的方法，質粒溶于生理鹽水中，每只小鼠注入100 μg質粒，使終體積(mL)為小鼠體質量(g)的1/10，使用一次性無菌注射器通過尾靜脈注入小鼠體內。注射前75%乙醇消毒，注射后用無菌棉球壓迫止血。不同時間點即8、24、48、72 h，每組取3只小鼠，從尾靜脈取血，每次每只約1 mL。不同時間點即8、24、48、72 h，引頸處死小鼠(每個時間點取3只小鼠)，取肝臟(從相同解剖部位取材)用于總RNA提取。其中B組喂養有96、120 h時間點上的小鼠，但由于肝組織提取污染，沒有進行總RNA提取。

1.2.3 RT-PCR檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內的表達 經過體內表達的KM小鼠，分別在相應的時間點，即0、8、24、48、72 h，給予每只小鼠去眼球取血后(留血清備用)，脫臼處死。無菌條件下，取肝組織，行RT-PCR檢測pcDNAmB7-H4-Fc在小鼠體內的表達。取5 μL PCR產物，加1 μL 6×上樣緩沖液混勻，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電壓梯度為10 V/cm，電泳40 min。用1%EB染液染色15 min，置紫外線投射儀觀察結果并拍照。采用Bandscan5.0軟件進行圖像分析，并以mB7-H4-hIg/β-actin mRNA 比值結果表示mB7-H4-hIg表達的水平。

1.2.4 融合蛋白mB7-H4-hIg分泌表達水平的檢測 mB7-H4-hIg蛋白中含有人IgG Fc片斷，因而檢測Fc即可間接反映B7-H4-hIg 融合蛋白的量。本研究采用抗人IgG多克隆抗體作為捕獲抗體包被酶標板，以人IgG作為標準品，并用HRP標記的抗人IgG單抗作為檢測抗體，建立ELISA法檢測mB7-H4-hIg融合蛋白水平。

2 結 果

2.1 雙抗體夾心ELISA法的建立及pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在體內的即時表達 本研究成功建立了檢測mB7-H4-hIg的ELISA檢測方法，最低檢測濃度為6.25 ng/mL；線性范圍為6.25～400.00 ng/mL，圖1為不同濃度人IgG標準品檢測繪制的標準曲線，r2=0.976 2，提示線性關系較好。采用建立好的ELISA檢測技術，測定小鼠可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白的表達，結果表明，經尾靜脈注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在體內表達，并且在48 h時間點分泌的量達到最高，最大量約120 ng/mL，見圖2。

圖1 可溶性整合蛋白mB7-H4-hIg的ELISA的標準曲線

圖2 轉染后小鼠血清mB7-H4-hIg濃度測定結果

2.2 B7-H4-Fc mRNA在體內的即時表達 本研究采用RT-PCR技術，取小鼠肝臟用于總RNA提取。結果表明，pcDNA3.1/mB7-H4-Fc經小鼠尾靜脈注射，能夠在小鼠肝臟內表達mB7-H4-Fc融合基因mRNA，并在48 h達到最高值，見圖3、4。

圖3 RT-PCR檢測小鼠肝臟mB7-H4-Fc mRNA表達

圖4 小鼠肝臟mB7-H4-Fc mRNA的表達水平

3 討 論

目前對B7-H4的研究主要集中在腫瘤方面，如卵巢癌[9]、胃癌[10]等，B7-H4在這些癌癥中均高表達。B7-H4在炎癥方面的研究較少，主要集中于類風濕關節炎[11]、腎病[12]等自身免疫性疾病。而關于B7-H4在自身免疫性肝炎中的表達情況尚少有相關研究。本研究思路為構建表達mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表達載體，并將該載體輸入小鼠體內，使其在肝臟內高表達可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白。

B7-H4[1]在單核/巨噬細胞、T細胞、B細胞和樹突狀細胞(DC)表面可誘導性表達，但在其他組織中不表達或低表達，說明B7-H4的表達可能存在某種調控機制。為了成功表達可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白，本研究采用了高水平真核表達系統pcDNA3.1(+)[7]，pcDNA3.1(+)在多種哺乳類細胞中穩定轉染或瞬時轉染時可高表達目的蛋白。該表達系統HAI還具有CMV啟動子和新霉素抗性基因供穩定表達篩選位點，尤其在COS-1和COS-7細胞中高表達。本課題前期研究已經成功地將人IgG1α Fc基因克隆到pcDNA3.1(+)多克隆位點，構建pcDNA3.1-hIg載體[7]，該載體無信號肽，故不能單獨表達人IgG1α Fc蛋白，但載體上游留取了多個酶切位點，為本研究表達帶人IgG Fc標簽的mB7-H4融合蛋白奠定了基礎。帶Fc標簽的融合蛋白具有如下優點[7]：(1)Fc可形成鏈間二硫鍵，使目的蛋白形成二價，有利于受體交聯，從而更有利于可溶性蛋白發揮生物學功能；(2)因攜帶Fc標簽，可用蛋白A或蛋白G親和層析法進行純化；(3)使可溶性蛋白分子增大，在體內難以降解；(4)應用抗Fc抗體即可方便地檢測。本研究在前期成功克隆mB7-H4基因的基礎上，構建了表達可溶性mB7-H4-hIg的真核表達載體pcDNA3.1/mB7-H4-Fc，并轉染COS-7細胞后成功表達了可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白。

流體動力法(hydrodynamics-based procedure)是將裸露DNA轉移到肝臟的較有效的辦法，目前已應用于IL-10[13]、HDV[14]、肝細胞生長因子[15]等基因在肝臟的表達，結果表明流體動力法能非常高效的將這些基因轉移到肝臟，并且獲得高水平表達。本項研究通過流體動力法將重組pcDNA3.1/ mB7-H4-Fc 表達載體導入小鼠體內，采用RT-PCR和ELISA檢測法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測mB7-H4-hIg在體內的表達水平和表達持續時間。采用建立好的ELISA檢測技術，測定小鼠可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白的表達，結果表明，經尾靜脈注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在體內表達，并且在48 h時間點分泌的量達到最高，最大量約120 ng/mL。采用RT-PCR技術，取小鼠肝臟用于總RNA提取。結果表明，pcDNA3.1/mB7-H4-Fc經小鼠尾靜脈注射，能夠在小鼠肝臟內表達mB7-H4-Fc融合基因mRNA，也在48 h達到最高值。這為進一步研究可溶性mB7-H4-hIg融合蛋白對Con A誘導肝損傷的保護作用奠定基礎。

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Experimental study of pcDNA3.1/mB7-H4-Fc expression of mice in vivo*

XiaoHuan1,2,PanWeimin1,2,WangChaoqun2,ChenHongyan2,XuJunfa3

(1.TeachingandResearchingSectionofNuclearMedicine;2.DepartmentofNuclearMedicine,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou,Hainan570102,China;3.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnosis,Dongguan,Guangdong523808)

Objective To obtain efficient and stable expression of recombination pcDNA3.1/mB7-H4-Fc in liver.Methods The eukaryotic expression vector for expressing mB7-H4 fusion protein was infused into the mouse body by adopting the hydrodynamic method.ELISA and real-time RT-PCR were used to quantitatively detect the pcDNA3.1/mB7-H4-Fc expression in mouse.Results The pcDNA3.1/mB7-H4-Fc by via tail vein injection could be stably expressed in liver tissue,which reached the highest at time point of 48 h,the maximal amount was about 120 ng/mL.Conclusion The pcDNA3.1/mB7-H4-Fc expression vector is successfully guided into the mouse liver and efficient and stable expression of pcDNA3.1/mB7-H4-Fc in liver is obtained.

B7-H4;PcDNA3.1/mB7-H4-Fc;hydrodynamics-based procedure

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.006

海南省衛生廳科研基金資助項目(瓊衛2010-3)；海南省自然科學基金資助項目(309393)。 作者簡介：肖歡(1976-)，副主任醫師，碩士研究生，主要從事分子探針及腫瘤免疫逃逸的研究。

R392.12

A

1671-8348(2016)05-0595-03

2015-05-08

2015-10-16)