302例海南黎族LDLR基因PvuⅡ多態性與血脂水平關系的研究*

羅顯云，孫民增，陳 林，張云波，褚麗秀，王天松，蔡望偉,姚 震，劉月麗

(1.湖北省竹山縣人民醫院心血管內科，湖北竹山 442200；2.海南省海南醫學院藥學院藥理教研室，海南海口 571101；3.海南省三亞市人民醫院心血管內科，海南三亞 572000；4.海南省海南醫學院理學院生化教研室，海南海口 571101)

論著·臨床研究

302例海南黎族LDLR基因PvuⅡ多態性與血脂水平關系的研究*

羅顯云1,2，孫民增3，陳 林3，張云波3，褚麗秀3，王天松3，蔡望偉4,姚 震3，劉月麗2△

(1.湖北省竹山縣人民醫院心血管內科，湖北竹山 442200；2.海南省海南醫學院藥學院藥理教研室，海南海口 571101；3.海南省三亞市人民醫院心血管內科，海南三亞 572000；4.海南省海南醫學院理學院生化教研室，海南海口 571101)

目的 探討海南地區黎族人群低密度脂蛋白受體(LDLR)基因PvuⅡ位點的多態性及其對血脂及載脂蛋白的影響。方法 采用分層隨機整群抽樣方法選取694例樣本(觀察組：黎族302例，對照組：漢族392 例)，抽取空腹靜脈血檢測血脂水平，運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測LDLR基因PvuⅡ多態性。結果 觀察組與對照組LDLR基因PvuⅡ 3種基因型P1P1、P1P2、P2P2頻率(66.89%vs.76.53%、27.81%vs.20.41%、5.30%vs.3.06%)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；觀察組等位基因P2頻率19.20%顯著高于對照組13.26%(P<0.01)。觀察組脂蛋白(a)[Lp(a)]、載脂蛋白B(apoB)水平顯著低于對照組(P<0.01)，觀察組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、載脂蛋白AI(apoAI)水平和apoAI/apoB比值顯著高于對照組(P<0.01)。兩組對象LDLR基因PvuⅡ各基因型與臨床血脂水平指標[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、apoAI、apoB、Lp(a)]差異無統計學意義(P>0.05)。結論 海南黎族人群LDLR基因存在PvuⅡ多態性，LDLR基因PvuⅡ多態性與血脂各項指標水平無相關性，P2等位基因不影響血脂代謝。

海南；黎族；LDLR基因；PvuⅡ多態性；血脂；載脂蛋白

低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)由Brown等[1]發現，認為LDLR與血脂代謝異常密切相關。LDLR基因突變與血脂異常相關性疾病密切相關[2]，LDLR基因的異常表達可導致低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)的清除障礙，使LDL-C在血漿中極度升高，導致高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等疾病[3-4]。由于基因多態性和基因頻率與不同國家、民族和地域的遺傳背景密切相關，所以研究不同人群的LDLR基因多態性對于追溯其起源、演化、遷移，以及探索其多態性與特定體質人群的相關性都有極其重要的意義[5]。本研究旨在探討海南黎族人群與漢族人群LDLR基因PvuⅡ酶切位點多態性及其與血脂水平的關系，為研究人類高脂血癥發生的機制提供遺傳學證據，并了解黎族人群高脂血癥的發病規律，為進一步研究黎族人群與高脂血癥相關疾病打下基礎[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2009 年10 月至2012 年6 月，采用分層隨機抽樣的方法選取生活在海南陵水、昌江縣及三亞地區黎族聚居村的黎族居民(三代以內父母雙方均為黎族的健康無血緣關系居民)共302名作為觀察組，其中男134名，女168名，年齡(43．48±18.24)歲；同時，采用同樣的抽樣方法選取當地的漢族聚居村的漢族居民共392名作為對照組，其中男192名，女200名，年齡(44.40±18.04)歲。入選標準：血壓、體質量指數(BMI)、心率均在正常范圍，心電圖檢查、心律聽診均正常者。排除標準：主要家族成員有神經系統障礙史、遺傳病史及患有影響血脂水平的急、慢性疾病和特殊生活習慣者(如糖尿病、垂體功能異常、甲狀腺疾病、慢性心、肺、肝、腎功能不全、長期酗酒、完全素食者)。所有研究對象均在入選前簽署書面知情同意書，得到海南醫學附屬醫院倫理委員會的許可。

1.2 方法

1.2.1 現場資料的收集 一般情況包括：如姓名、性別、年齡、民族、職業、居住情況、吸煙情況(不吸；少量吸煙，<20支/天；大量吸煙，≥20支/天)、飲酒情況(不飲；少量飲酒，<250 g/d；大量飲酒，≥250 g/d)及文化程度等。體格檢查項目包括：身高、體質量、腰圍、血壓和心電圖檢查等。按體質量(kg)/身高(m2)計算BMI。

1.2.2 標本采集與保存 所有入選者采血前2周保持平時飲食習慣，24 h 內不進食高膽固醇飲食，不飲酒，不做劇烈運動，于早上9 點之前空腹采前臂肘靜脈血10 mL，其中非抗凝血6 mL，分離血清用于測定血脂，4 mL用乙二胺四乙酸二鉀(K2EDTA)抗凝，置于冰箱-80 ℃保存，用于提取基因組DNA。

1.2.3 血脂測定 血脂測定由三亞市人民醫院臨床檢驗中心完成，包括以下項目：總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)、載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]。

1.2.4 DNA提取 采用康為世紀生物科技有限公司提供的血液基因組小量提取試劑盒按說明提取DNA。

1.2.5 聚合酶鏈反應(PCR) 引物序列參照文獻[7]，由上海生物工程技術服務有限公司合成引物合成。引物序列：上游為5′-TCC CCT TCA AAA TGC CCT CTT-3′，下游為5′-TGG GCT TCT TCT CAT TTC CTC-3′。擴增反應體系：DNA提取物3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×EcoTaq PCR SuperMix 12.5 μL，RNase-Free Water 7.5 μL，總體積25 μL混勻，經4 000 r/min 瞬時離心后，放入PCR儀內進行擴增。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共 35個循環，72 ℃再延伸7 min，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠放入凝膠成像系統里觀察結果。

1．2．6 限制性片段長度多態性(RFLP)分析 酶切反應體系及條件：PCR 產物10.0 μL，10×NEB Buffer 2.0 μL，PvuⅡ-HF限制性內切酶1 μL，ddH2O 17 μL，總體積30 μL，混勻，3 000 r/min瞬時離心后，置于37 ℃恒溫水浴箱中酶切8 h，2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，基因頻率采用基因計數法，用Hardy-Weinberg 平衡定律檢測樣本的群體代表性。黎族和漢族基因型及等位基因頻率比較用χ2檢驗；基因型血脂水平比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組對象一般情況比較 兩組對象性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、脈壓等指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組的身高、體質量低于對照組(P<0.01)；吸煙率、飲酒率高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組對象一般情況比較

2.2 兩組對象LDLR基因PvuⅡ酶切結果 本研究所得LDLR基因PvuⅡ酶切片段(圖1)有3 種：如在1 148 bp處出現一條強熒光帶即P1P1型純合子基因型，在1 148 bp處出現一條強熒光帶，在951 bp及197 bp也出現兩條光帶，共3條電泳帶為P1P2型雜合子基因型，如果在951 bp及197 bp出現兩條光帶為P2P2型純合子基因型。

M：標記物；1：P1P1基因型；2：P1P2基因型；3：P2P2基因型。

圖1 LDLR目標擴增片段的PvuⅡ酶切電泳圖

2.3 兩組對象LDLR基因PvuⅡ基因型和等位基因的頻率分布及基因型頻率分布 兩組對象基因型及等位基因頻率的分布情況，見表2。觀察組P1P2及P2P2基因型頻率比對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組等位基因P2頻率為19.20%，對照組為13.26%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。觀察組基因型頻率分布的Hardy-Weinberg平衡定律檢測結果顯示，觀察組和對照組的基因型實際頻數與理論頻數比較，差異均無統計學意義(χ2=1.55、1.95，P=0.46、0.38)，見表3。

表2 兩組對象LDLR基因PvuⅡ基因型及等位基因 頻率的比較[n(%)]

2.4 兩組對象血脂水平比較 觀察組Lp(a)、apoB水平顯著低于對照組(P<0.01)，觀察組HDL-C、apoAI水平和 apoAI/apoB比值顯著高于對照組(P<0.01)。黎族和漢族人群血脂水平比較，見表4。

2.5 兩組對象LDLR基因PvuⅡ不同基因型血脂水平比較 兩組對象LDLR基因PvuⅡ各基因型與臨床血脂水平指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5、6。

表3 兩組對象LDLR基因PvuⅡ基因型分布Hardy- Weinberg平衡定律檢測[n(%)]

表4 兩組對象血脂水平比較±s)

表5 觀察組LDLR基因PvuⅡ不同基因型血脂水平比較±s)

表6 對照組LDLR基因PvuⅡ不同基因型血脂水平比較±s)

3 討 論

LDLR基因在人類基因組位于第19號染色體短臂末端(19p13.1～13.3)，在基因組中的長度大于45 kb，含有18個外顯子，被17個內含子分隔開。LDLR基因PvuⅡ位點的RFLP位于15內含子的3′末端，此酶切位點(CAGCTG)是由于外顯子16連接點5′端約第600個堿基(CAGCCG)序列內的第5個堿基C→T突變所產生[8]。研究發現LDLR基因PvuⅡ位點多態性發生頻率與不同的國家、地域、民族和種族相關[9]，其多態性導致人群的LDL-C和TC水平及體內脂肪組織的堆積異常[10]。Pedersen 等[11]首先發現挪威人群Pvu II酶切位點缺失者血清TC水平明顯高于位點存在者(P<0.05)。Vourio 等[12]證實15內含子PvuⅡ位點多態性與血清中高TC水平相關。董治亞等[13]發現單純性高膽固醇血癥患兒PvuⅡ酶功位點等位基因缺失與較高的TC水平相關。

目前運用PCR-RFLP方法檢測LDLR基因15內含子PvuⅡ位點多態性進行基因診斷和篩查，是一種成熟的技術。國內最早由周天鴻等設計相應的引物，用于家族性高膽固醇血癥的基因診斷[8]。本研究中發現黎族人群組LDLR基因PvuⅡ位點有酶切位點的等位基因P2頻率為19.20%，明顯高于對照組13.26%(P<0.01)，表明觀察組LDLR基因PvuⅡ位點存在多態性，可以作為海南黎族人群的一個遺傳學標記，與金京姬[14]研究延邊朝鮮族人群LDLR基因PvuⅡ多態性時發現其可以作為朝鮮族的一個遺傳標記結果相似。觀察組的身高、體質量低于對照組(P<0.01)，吸煙率、飲酒率高于對照組(P<0.01)，可能與種族遺傳及海南獨特的環境及生活習慣相關。觀察組Lp(a)、apoB水平顯著低于對照組(P<0.01)，HDL-C、apoAI水平和 apoAI/apoB比值顯著高于對照組(P<0.01)，與張云波等[15]在海南地區黎族人群血脂水平調查研究結果一致。

在對黎、漢族人群LDLR基因PvuⅡ不同基因型血脂水平相關性分析中發現，黎、漢族人群PvuⅡ各基因型與臨床血脂水平差異無統計學意義(P>0.05)，表明PvuⅡ位點多態性與血脂水平無相關性，P2等位基因不影響海南黎族人群血脂代謝。皮靜波等[16]等研究海南黎族人群LDLR基因AvaⅡ多態性與血脂的相關性時發現，僅TC與AvaⅡ不同基因型相關。在延邊朝鮮族人群LDLR 基因多態性與原發性高血壓相關性研究中發現LDLR基因Asn591Asn位點的不同基因型血脂水平間差異無統計學意義(P>0.05)[17]，與本研究結果一致。

由于體內脂質的代謝過程受到血脂的多種基因和(或)多種環境因素共同作用影響，對于一個基因而言，其某一個位點的突變常常與其他的位點的突變共同存在，共同影響血脂代謝，同時也受到環境的作用共同影響體內的脂質水平[18]，所以在對基因與血脂水平的相關性分析時要充分考慮到基因與基因，基因與環境的相互作用的影響。本研究僅針對LDLR基因的一個變異位點進行分析，對于這個基因位點的變異是否還存在著連鎖不平衡的位點還有待進一步的探討和聯合分析。

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Research on association between PvuⅡ polymorphism of LDLR gene and blood lipid level among 302 Li people in Hainan province*

LuoXianyun1,2,SunMinzeng3,ChenLin3,ZhangYunbo3,ChuLixiu3,WangTiansong3,CaiWangwei4,YaoZhen3,LiuYueli2△

(1.DepartmentofCardiovascularDiseases,ZhushanCountyPeople′sHospital,Zhushan,Hubei442200,China;2.TeachingandResearchingSectionofPharmacology,PharmacySchoolofHainanMedicalCollege,Haikou,Hainan571101,China；3.DepartmentofCardiovascularDiseases,SanyaMunicipalPeople′sHospital,Sanya,Hainan572000,China;4.TeachingandResearchingSectionofBiochemistry,ScienceSchoolofHainanMedicalCollege,Haikou,Hainan571101,China)

Objective To study the PvuⅡ locus polymorphism of low density lipoprotein receptor(LDLR) gene among the Li people in Hainan area,and to evaluate its impact on serum apolipoproteins and blood lipids.Methods 694 samples(observation group:302 cases of Li people,the control group:392 cases of Han people) were selected by using the stratified random cluster sampling method.Fasting venous blood was collected for detecting serum lipid level,the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was employed to detect PvuⅡpolymorphism in LDLR gene.Results The frequencies of genotype P1P1,P1P2 and P2P2 of LDLR gene PvuⅡin the observation group and the control group were 66.89%vs.76.53%,27.81%vs.20.41%,5.30%vs.3.06% respectively,the differences were statistically significant(P<0.05);the frequency of allele P2 in the observation group was significantly higher than that in the control group(19.20%vs.13.26%,P<0.01).The Lp(a) and apoB levels in the observation group were significantly lower than those in the control group(P<0.01).However,the HDL-C,apoAI levels and apoAI/apoB ratio in the observation group were significantly higher than those in the control group(P<0.01).The various genotypes of LDLRgene Pvu Ⅱ and clinical blood lipid levels[such as TC,TG,HDL-C,LDL-C,apoAI,apoB,Lp(a)] had no statistical differences between the two groups(P>0.05).Conclusion PvuⅡ polymorphism exists in LDLR gene among Li people in Hainan area.The LDLR gene PvuⅡ polymorphism has no correlation with the levels of various blood lipid indicators.P2 allele does not affect the lipid metabolism.

Hainan;Li people;LDLR gene;PvuⅡ polymorphism;serum lipid;apolipoproteins

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.010

國家自然科學基金資助項目(81260060)；海南省自然科學基金資助項目(30726)。 作者簡介：羅顯云(1973-)，主治醫師，碩士研究生，主要從事血脂與動脈粥樣硬化相關方面的研究△

，Tel:13617547436;E-mail:lyl20041981@126.com。

R589.2

A

1671-8348(2016)05-0610-04

2015-07-15

2015-10-12)