膿毒癥患者血小板微粒與微RNA-155水平的變化規律及意義*

楊婉花，張宏澤，劉鴻翔，劉長芳，葉冬英，石 斌△，劉景全

(1.上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院急診危重病科，上海 201600；2 浙江省人民醫院ICU，浙江杭州 310014)

論著·臨床研究

膿毒癥患者血小板微粒與微RNA-155水平的變化規律及意義*

楊婉花1，張宏澤1，劉鴻翔1，劉長芳1，葉冬英1，石 斌1△，劉景全2

(1.上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院急診危重病科，上海 201600；2 浙江省人民醫院ICU，浙江杭州 310014)

目的 探討血小板微粒(PMPs)和微RNA(miRNA)-155與膿毒癥患者病情和預后的關系。方法 選擇膿毒癥患者61例，根據28 d預后將其分為存活組和死亡組；根據病情嚴重程度將其分為膿毒癥組、嚴重膿毒癥組及膿毒癥休克組。比較各組患者APACHEⅡ評分，使用流式細胞儀進行PMPs定量，利用實時熒光定量PCR檢測患者血漿miRNA-155水平。Spearman相關性分析確認PMPs水平、miRNA-155水平與患者APACHEⅡ評分的關系。結果 與存活組比較，死亡組患者PMPs水平較高(P<0.05)。膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒癥休克3組患者的PMPs水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。死亡組患者的miRNA-155水平相對于存活組提高(P<0.05)，嚴重膿毒癥組及膿毒癥休克組患者的miRNA水平較膿毒癥組明顯提高(P<0.05)。患者PMPs水平及miRNA-155水平均與APACHEⅡ評分呈正相關，同時患者PMPs水平與microRNA-155水平也呈正相關。PMPs水平聯合miRNA-155水平預測膿毒癥患者死亡的ROC曲線下面積達0.831。結論 膿毒癥患者的PMPs水平及miRNA-155水平與膿毒癥患者的病情及預后有關，miRNA-155可能引起膿毒癥患者的PMPs水平增高。

膿毒癥；血小板微粒；微RNAs；預后

膿毒癥的發病機制和病理、生理過程十分復雜，涉及內皮損傷、炎癥反應、免疫功能紊亂以及凝血功能紊亂等諸多環節[1]。既往研究多關注炎癥反應中的指標，諸如白細胞介素(IL)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等的變化，或者血流動力學指標以及凝血功能等指標的變化[2]。近期，大量研究開始關注血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)在膿毒癥發生及發展過程中的作用，PMPs是從活化的血小板表面脫落的微小顆粒，除介導凝血功能外，還可參與炎癥因子的釋放及調節血管的舒縮功能，因而在膿毒癥中發揮重要作用[3]，但關于PMPs和膿毒癥患者病情及預后關系的報道還較少見，分子生物學機制也尚未清楚。微RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核生物體內的非編碼短鏈RNA，可通過沉默靶基因的表達實現生物調控作用，因此其與多種疾病有關，是近年來熱門的分子生物指標。大量研究表明，膿毒癥患者存在miRNA的表達變化，miRNA在膿毒癥的發生、發展過程中，除了具有免疫調節和炎性調控作用外，還可能通過調節血小板的活化來影響膿毒癥的進展[4-5]。近期，關于miRNA-155的研究較多，既往研究已經證實膿毒癥中存在miRNA-155的高表達[6]，但是在膿毒癥中，miRNA-155是否影響血小板的活化，是否與PMPs有關，還不得而知。因此，本研究探討膿毒癥患者預后與PMPs的關系，并進一部證實miRNA-155在此過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年5月至2014年10月上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院急診危重病科收治的膿毒癥患者61例，其中男38例，女23例，平均年齡(56.00±8.00)歲。納入對象均依據美國胸科醫師學會和美國危重病醫學會在2001年華盛頓國際膿毒癥會議中制定的定義確診為膿毒癥。排除標準：(1)年齡小于18歲；(2)急性心肌梗死、心源性休克；(3)心、肝、腎、肺等既往存在嚴重的慢性疾病；(4)近期服用過抗血小板藥、降糖藥、調脂藥等對血小板活化有影響的藥物；(5)入院前使用大量兒茶酚胺類藥物；(6)因各種原因中途放棄治療及入住ICU后24 h內死亡。

1.2 方法

1.2.1 患者分組 依照國際嚴重膿毒癥和膿毒癥休克管理治療指南(2012年版)建議的方法對患者進行規范化治療。根據治療28 d的預后將納入對象分為存活組(n=40)和死亡組(n=21)。根據病情的嚴重程度，將研究對象分為膿毒癥組(n=21)、嚴重膿毒癥組(n=15)及膿毒癥休克組(n=25)。各組患者的年齡、性別、感染部位、病史等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2 觀察指標 (1)常規記錄患者的性別、年齡、病史、感染原因，監測患者體溫、呼吸、心率、血流動力學指標等生命體征。計算入院24 h內急性生理學和慢性健康評分Ⅱ(APACHEⅡ)。(2)采集患者膿毒癥診斷成立后12 h內靜脈血標本(以晨起空腹靜脈血最佳)3.00 mL，枸櫞酸抗凝，低速離心后分離血漿標本。使用FACSort流式細胞系統檢測PMPs，按照馬文新等[7]報道的標準微球法定位法處理血漿標本、設定流式細胞儀參數并按所報道公式計算血漿標本中的PMPs的絕對量。熒光標記采用FITC-CD61(FITC標記的抗血小板膜糖蛋白GPⅢa抗體，購自美國貝克曼庫爾特公司)。(3)采集膿毒癥診斷成立的12 h內患者靜脈血，使用MiRcute miRNA 提取分離試劑盒(購自北京天根生物科技有限公司)，按照廠商說明書中方案提取血漿標本中的miRNA，測定純度和濃度后，使用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒(購自美國Life Technologies公司)將獲取的miRNA反轉為cDNA，反轉錄體系和條件按照廠商說明書設置。對獲得的cDNA進行qRT-PCR擴增，試劑盒采用GoTaq qPCR Master Mix(購自北京普洛麥格生物技術有限公司)，反應體系和條件參考說明書。相關引物序列參考文獻[8]進行設計，其中，miRNA-155上游引物序列：5′-CGT TAA TGC TAA TCG TGA TAG-3′，下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG G-3′；使用U6 snRNA 作為內參，其上游引物序列： 5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以2-△△c t表示各組miRNA-155相對于對照組(膿毒癥組或存活組)的表達水平，△ct=ct目標-ct內參。

2 結 果

2.1 PMPs與膿毒癥患者病情及預后的關系 流式細胞儀分析發現，膿毒癥組患者的PMPs水平為(6.25±0.19)×105/mL，嚴重膿毒癥組患者的PMPs水平為(7.12±0.31)×105/mL，兩組比較差異有統計學意義(t=7.01，P<0.05)。膿毒癥休克組患者的PMPs水平最高，為(8.17±0.22)×105/mL，與膿毒癥組及嚴重膿毒癥組比較，差異均有統計意義(t=6.42、2.33，P<0.05)。預后方面，存活組患者的PMPs水平為(6.58±0.25)×105/mL，死亡組患者的PMPs水平為(8.53±0.18)×105/mL，兩組比較差異有統計學意義(t=2.61，P<0.05)。相關性分析發現，患者PMPs水平與APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.68，P<0.05)，見圖1。該結果提示較高PMPs水平的膿毒癥患者病情較重，預后較差。

圖1 PMPs水平與APACHEⅡ評分的關系

2.2 miRNA-155與膿毒癥患者病情及預后的關系 相對于膿毒癥組患者，嚴重膿毒癥患者的miRNA-155水平提高了(1.41±0.03)倍，兩組比較差異有統計學意義(t=10.03，P<0.05)。膿毒癥休克組患者的miRNA-155水平最高，相對于膿毒癥組患者，提高了(1.72±0.06)倍，兩組比較差異有統計意義(t=10.05，P<0.05)。預后方面，死亡組患者的miRNA-155水平相對于存活組提高了(1.51±0.04)倍，兩組比較差異有統計學意義(t=14.83，P<0.05)。若以2-ΔΔct表示各組miRNA-155的水平，相關性分析發現，患者miRNA-155水平與APACHEⅡ呈正相關(r=0.62，P<0.05)，見圖2。提示較高miRNA-155水平的膿毒癥患者病情較重，預后較差。

圖2 miRNA-155水平與APACHEⅡ評分的關系

2.3 PMPs與miRNA-155水平及二者聯合預測膿毒癥患者預后的價值 相關性分析發現，患者PMPs水平與miRNA-155水平呈正相關(r=0.68，P<0.05)，見圖3。使用APACHEⅡ評分、PMPs、miRNA-155及PMPs聯合miRNA-155指標預測膿毒癥患者的預后,見圖4，4種指標的ROC曲線下面積分別為0.691(95%CI：0.533～0.849，P<0.05)，0.716(95%CI：0.558～0.873，P<0.05)，0.831(95%CI：0.693～0.970，P<0.05)，0.831(95%CI：0.693～0.970，P<0.05)。PMPs預測膿毒癥患者預后的臨床價值與傳統的APACHEⅡ評分類似，但聯合miRNA-155指標后，其臨床價值更佳。

圖3 microRNA-155水平與PMPs計數的關系

圖4 4種指標預測膿毒癥患者死亡的ROC曲線

3 討 論

PMPs是血小板再活化過程中從脂膜表面釋放的一種超微膜性囊泡，直徑在1 μm以下，它可以促進血栓的形成與延伸，并進一步活化血小板。研究認為PMPs是血小板信息傳遞的載體，可參與血栓性疾病和炎性疾病[9]。膿毒癥作為感染引起的全身炎癥反應，有可能存在PMPs的表達異常。但是由于檢測技術的局限性，很難對PMPs進行檢測計數，因此長期以來，PMPs在膿毒癥中的實踐應用較少有報道。近年來，隨著流式細胞術及生物標記技術的發展，PMPs的定量檢測已經變得具有可行性[10]。

本研究通過流式細胞術對膿毒癥患者的PMPs進行了定量，發現病情嚴重或者預后較差的膿毒癥患者PMPs水平較高，意味著過多的PMPs不利于膿毒癥患者的預后。結合既往文獻，本研究認為過量PMPs影響膿毒癥患者病情和預后的可能機制為：(1)PMPs表面的磷酯酰絲氨酸為凝血酶原復合物提供了催化表面，其帶負電的磷脂表面也為凝血因子提供了結合位點，大量的PMPs出現造成凝血功能紊亂，導致凝血亢進，形成廣泛的微血栓，增加微循環障礙和休克風險，其次繼發的纖溶亢進也可威脅膿毒癥患者生命。(2)PMPs可以參與內皮源性及單核源性細胞因子的釋放，比如造成IL、TNF-α的失控，造成膿毒癥患者進一步的炎癥反應失控。(3)PMPs引起的炎癥因子釋放可以造成內皮損傷，而內皮損傷是膿毒癥中關鍵的病理生理現象，如損傷的內皮增加血栓形成風險，影響血管收縮調控因子釋放紊亂，引起血管通透性的增加，進而導致炎性物質的擴散。(4)PMPs可作為細菌傳播的載體，過多的PMPs增加了細菌播散的風險[11-13]。

另外，除了關注PMPs水平外，本研究還關注了膿毒癥患者miRNA-155的水平變化。因為近期關于膿毒癥和miRNA關系的研究比較熱門。研究證實一些miRNA可調控炎癥通路來影響炎癥反應的強度，從而影響膿毒癥的發生、發展。如有研究表明miRNA-9可以降低NF-κB活性，發揮促炎作用，不利于膿毒癥的預后[14]。至于miRNA-155，有研究發現在膿毒癥小鼠模型中，miRNA-155可以提高TNF-α，促進炎癥反應，導致膿毒癥小鼠的高病死率[15]。還有研究指出，miRNA-155可以調節膿毒癥患者的T細胞亞群比例，使具有免疫抑制功能的調節性 T 細胞比例增加，從而導致患者免疫抑制，引起較差的預后[16]。雖然各研究中miRNA-155的作用機制不同，但miRNA-155對膿毒癥的影響是一致的，即引起較差的預后。本研究發現病情較重、預后較差的膿毒癥其miRNA-155水平較高，也證明miRNA-155在膿毒癥中扮演一定的角色，其高表達是預后不良的危險因素。這與既往研究基本一致。本研究還將miRNA-155水平與PMPs水平聯系起來，發現miRNA-155水平與PMPs定量水平呈正相關，提示膿毒癥中較高的miRNA-155可能引起患者PMPs過度增多，過多的PMPs再通過上述的4個機制影響患者預后。同時本研究認為miRNA-155可能通過刺激血小板活化，進而增加了PMPs水平。一些研究已經證實了miRNA具有調節活化血小板的作用，如Bender等[17]認為miRNA主要通過調節PI3K/Akt信號通路來實現對血小板活化的調節。當然在膿毒癥中，miRNA-155是如何調節血小板活化并增加PMPs的，還有待研究。總之，本研究認為過高的PMPs定量水平和miRNA-155水平提示膿毒癥患者預后不良，miRNA-155可能增加PMPs的釋放。

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Change rule and significance of platelet microparticles and microRNA-155 level in patients with sepsis*

YangWanhua1,ZhangHongze1,LiuHongxiang1,LiuChangfang1,YeDongying1,ShiBin1△，LiuJingquan2

(1.DepartmentofEmergencyCriticalDisease,SongjiangBranchHospital,FirstAffiliatedPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China;2.ICU,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310014,China)

Objective To investigate the relationship between platelet microparticles(PMPs) and microRNA-155 with the disease condition and prognosis in the patients with sepsis.Methods 61 patients with sepsis were selected and divided into the survival group and the death group according to the 28 d prognosis.And all cases were divided into the sepsis group,severe sepsis group and sepsis shock group according to the severity of sepsis.The APACHEⅡ scores were compared among various groups.The Spearman correlation analysis was used to determine the correlation between the levels of PMPs and miRNA-155 with the APACHEⅡ scores.The plasma PMPs level was quantitatively detected by the flow cytometry and the plasma miRNA-155 level was detected by the quantitative RT-PCR.The Spearman correlation analysis was performed to determine the relationship between the PMPs and microRNA-155 level with the APACHEⅡscore.Results The PMPs level in the death group was higher than that in the survival group(P<0.05).The PMPs level had statistical differences among the sepsis group,severe sepsis group and sepsis shock group(P<0.05).The miRNA level in the death group was higher than that in the survival group(P<0.05),the miRNA level in the severe sepsis group and the sepsis shock group was increased compared with the sepsis group(P<0.05).The levels of PMPs and miRNA-155 were positively correlated with the APACHEⅡscore,meanwhile,the PMPs level in the patients was positively correlated with microRNA-155 level.The area under curve(AUC) of ROC curve in the PMPs combined with miRNA-155 for predicting the death of sepsis patients reached 0.831.Conclusion The PMPs and miRNA-155 levels are correlated with the disease condition and prognosis in the patients with sepsis.miRNA could cause the increase of PMPs level in sepsis patients.

sepsis;platelet microparticles;microRNAs;prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.014

上海市松江區衛生局領先專業課題資助項目(2011SJGG27)。 作者簡介：楊婉花(1971-)，副主任醫師，大學本科，主要從事重癥醫學、重癥心血管疾病診治的研究。△

，Tel：18918288036；E-mail：shib_shanghai@163.com。

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1671-8348(2016)05-0622-03

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2015-10-14)