SLE患者外周血濾泡輔助性T細胞的檢測及其臨床意義

趙 珊，俞 娟，張 虹

(云南省第一人民醫院風濕免疫科，云南昆明 650032)

論著·臨床研究

SLE患者外周血濾泡輔助性T細胞的檢測及其臨床意義

趙 珊，俞 娟，張 虹△

(云南省第一人民醫院風濕免疫科，云南昆明 650032)

目的 探討濾泡輔助性T細胞(Tfh)在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血的比例及其臨床意義。方法 收集60例SLE患者(SLE組)及60例健康體檢者(對照組)外周血，采用流式細胞術方法檢測CXCR5+ICOS+的CD4+T細胞(即Tfh細胞)的比例，并分析Tfh細胞比例與患者疾病活動度及自身抗體的相關性。結果 SLE組患者外周血Tfh細胞比例明顯高于對照組(t=5.830，P<0.01)，且SLE活動組明顯高于SLE穩定組(t=7.313，P<0.01)，但狼瘡腎炎組患者Tfh比例與無腎炎狼瘡組比較，差異無統計學意義(t=0.986，P=0.328)。SLE患者外周血Tfh細胞比例與疾病活動度、血清總IgG、抗核抗體滴度及抗ds-DNA均呈正相關(P<0.05)。結論 SLE患者外周血Tfh細胞的比例升高可能與患者疾病的發生及發展有關。

紅斑狼瘡，系統性；濾泡輔助性T細胞；自身抗體

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythmatosus，SLE)是一種累及多個器官的慢性系統性自身免疫病，其發病機制極其復雜。B細胞的異常活化及大量自身抗體的產生是其一個重要的病理特征[1]，但B細胞的活化、分化及抗體的產生都離不開CD4+T細胞的輔助。濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cells，Tfh)是近年來新發現的一群細胞，高表達趨化因子CXCR5，定位于淋巴器官的淋巴濾泡，是真正輔助B細胞產生抗體的CD4+T細胞[2-3]。動物實驗已證明Tfh細胞的數量和功能異常增強能導致小鼠淋巴生發中心增多，自身抗體水平增加，并表現為系統性自身免疫病的癥狀[4]。本文通過檢測SLE患者外周血中Tfh細胞的比例，并分析其與疾病活動度及自身抗體水平的相關性，探索Tfh細胞在人SLE疾病發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年6月至2014年8月來本院風濕科就診的SLE患者60例(SLE組)，其中男5例，女55例；年齡21～58歲，平均(37.62±9.81)歲。SLE的診斷均按照1997年美國風濕病學會制定的診斷標準[5]。采用SLE疾病活動度(SLE disease activity index，SLEDAI)對SLE患者進行評分，SLEDAI≥8分為SLE活動組，SLEDAI<8分為SLE穩定組[6]；另外，根據患者是否合并腎炎將SLE患者分為狼瘡腎炎組(平均SLEDAI為8.43分)和無腎炎狼瘡組(平均SLEDAI為8.25分)。選擇同時期來本院進行健康體檢者60例(對照組)，男7例，女53例；年齡20～61歲，平均(38.43±9.76)歲，排除各種自身免疫病及肝腎功能不全等疾病。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術檢測Tfh細胞 無菌采取抗凝外周血5 mL，加5 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)混勻后，輕輕疊加至10 mL 淋巴細胞分離液Ficoll(Sigma公司)上，2 000 r/min離心20 min后吸取中間白色單個核細胞層；以PBS洗滌2次后加入抗體組合CD3-Percp，CD4-APC，CXCR5-FITC，ICOS-PE各1 μL，室溫孵育30 min；加PBS洗滌2遍，重懸于200 μL PBS中上機檢測。將CXCR5+ICOS+的CD4+T細胞定義為Tfh細胞[7]。

1.2.2 血清自身抗體檢測 血清總IgG及抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)的測定采用間接免疫熒光法，試劑盒購自Bio-Rad公司；血清抗ds-DNA抗體測定采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，試劑盒購自Seraamun Diadnostic GmbH診斷公司。操作均嚴格按照試劑盒的要求進行。

2 結 果

2.1 兩組對象外周血Tfh細胞百分比比較 對照組外周血Tfh細胞在CD4+T細胞所占的比例為(1.28±0.94)%，SLE組患者外周血Tfh細胞的比例為(2.57±1.44)%，兩組比較差異有統計學意義(t=5.830，P<0.01)，見圖1。

2.2 SLE組患者各亞組間Tfh細胞百分比比較 SLE活動組外周血Tfh細胞為(3.43±1.05)%，顯著高于SLE穩定組(1.55±0.86)%及對照組(1.28±0.94)%，差異均有統計學意義(P<0.01)，SLE穩定組Tfh細胞比例略高于對照組，但差異無統計學意義(t=1.493，P=0.139)；狼瘡腎炎組患者外周血Tfh細胞為(2.74±1.19)%略高于無腎炎狼瘡組(2.45±1.10)%，但差異無統計學意義(t=0.986，P=0.328)。

2.3 SLE患者Tfh細胞百分比與SLEDAI及自身抗體的相關性 Tfh細胞的比例與SLEDAI呈正相關(r=0.533,P=0.000)；Tfh細胞的比例與血清總IgG及抗ds-DNA呈正相關(均P<0.01)，與ANA的滴度也有微弱相關性(r=0.340,P=0.032)，見圖2。

a:P<0.01，與對照組比較。

圖1 兩組對象外周血Tfh細胞百分比比較

圖2 SLE患者外周血Tfh細胞百分比與SLEDAI及自身抗體的相關性分析

3 討 論

Tfh是近年來新發現的一類區別于Th1、Th2、Th17、Treg的新型CD4+T細胞亞群。Tfh細胞定位于淋巴器官的濾泡區，表面高表達趨化因子受體CXCR5及共刺激分子ICOS[7]；Bcl-6是Tfh細胞的關鍵轉錄因子，控制CD4+T細胞朝Tfh細胞定向分化[8]；IL-21是Tfh細胞重要功能性細胞因子，可促進B細胞的增殖、分化及漿細胞的發育、成熟和抗體的分泌[9]。Tfh細胞在生發中心的形成過程中扮演重要角色，Tfh細胞敲除的小鼠生發中心形成缺陷，B細胞發育障礙，抗體產生降低[10]。相反，一些自身免疫疾病小鼠Tfh細胞水平升高，造成生發中心過度增生，甚至出現異位生發中心的形成[11]，并誘導B細胞的過度活化及自身抗體的過度分泌[12-13]。上述動物實驗證實Tfh細胞與自身免疫病及自身抗體的密切關系，本研究在此基礎上探討Tfh細胞在人SLE疾病發生、發展過程中的作用，為SLE的病理機制研究及免疫干預策略提供實驗依據。

通過流式細胞術檢測CD4+T細胞表面CXCR5及ICOS的表達情況，將CXCR5+ICOS+的CD4+T細胞定義為Tfh細胞，本研究發現SLE患者外周血的Tfh細胞在CD4+T細胞中的比例明顯高于對照組。該結果與已有的文獻報道一致[14]，說明SLE患者存在Tfh細胞的過度增殖。另外通過比較活動期和穩定期SLE患者的Tfh差異，發現活動期SLE患者的Tfh細胞比例明顯高于穩定期患者，說明Tfh細胞在SLE患者疾病活動過程中扮演角色，可能參與介導SLE疾病的發病。但是根據患者是否合并腎炎將SLE患者分為狼瘡腎炎組和無腎炎狼瘡組，兩組患者的Tfh細胞比例比較差異無統計學意義(t=0.986，P=0.328)，考慮到兩組患者SLEDAI評分比較差異無統計學意義(8.43vs.8.25，P>0.05)，說明Tfh細胞與SLE患者的合并癥無關，僅反映疾病的活動狀態。

大量自身抗體的產生是SLE疾病的重要發病機制之一，鑒于Tfh細胞在輔助B細胞分化發育過程中的重要作用[15]，推測Tfh細胞可能通過介導B細胞的過度活化及自身抗體的大量產生參與SLE的發病機制。分析Tfh細胞比例與SLE疾病活動度的相關性發現Tfh細胞比例與SLE疾病活動度成顯著正相關，說明Tfh細胞是SLE疾病出現活動性的重要因素之一。另外，分析Tfh細胞比例與血清總抗體水平及自身抗體ANA滴度及抗ds-DNA水平的相關性，發現Tfh細胞與這些抗體水平均呈正相關，說明Tfh細胞是誘導自身抗體產生及總抗體水平升高的重要機制之一。

總之，本文通過檢測SLE患者外周血的Tfh細胞比例，并分析其與疾病活動度及自身抗體水平的相關性，揭示Tfh細胞通過介導自身抗體的過量產生誘發SLE疾病活動度升高，為針對Tfh細胞的免疫治療提供理論依據。

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Detection and clinical significance of peripheral blood follicular helper T cells in SLE patients

ZhaoShan,YuJuan,ZhangHong△

(DepartmentofRheumatology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the percentage of peripheral blood follicular helper T (Tfh) cells and its clinical significance in the patients with systemic lupus erythmatosus (SLE).Methods 60 patients with SLE(SLE group) and 60 individuals undergoing the healthy physical examination (control group) were collected and detected the percentage of CXCR5+ICOS+CD4+T cells by using the flow cytometry.The correlation between Tfh cells with the disease activity of SLE and auto-antibodies was also analyzed.Results The percentage of peripheral blood Tfh cells in SLE patients was significantly higher than that in the control group (t=5.830,P<0.01),moreover the active SLE group was significantly higher than the stable SLE group (t=7.313,P<0.01);but the percentage of Tfh cells had no statistical difference between the lupus nephritis group and the non-lupus nephritis group (t=0.986，P=0.328).The percentage of peripheral blood Tfh cells had significantly positive correlation with the disease activity index (DAI) of SLE,serum total IgG,anti-nuclear antibody (ANA) titer and anti-ds-DNA.Conclusion Increase of peripheral blood Tfh cells percentage in the SLE patients might contribute to the occurrence and development of SLE.

lupus erythmatosus,systemic;follicular helper T cells;autoantibodies

趙珊(1972-)，副主任醫師，碩士研究生，主要從事結締組織病合并肺間質纖維化、肺動脈高壓、感染、冠心病的臨床診治研究。△

，Tel：13577008899；E-mail：0428zhanghong@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.05.019

R392.7

A

1671-8348(2016)05-0636-03

2015-07-24

2015-10-22)