組蛋白甲基化抑制劑DZNep對小鼠缺血再灌注損傷腎臟的保護作用

李佳蔚， 李　龍， 張　潮， 王繼納， 戎瑞明

復旦大學附屬中山醫院泌尿外科, 上海　200032

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·論著·

組蛋白甲基化抑制劑DZNep對小鼠缺血再灌注損傷腎臟的保護作用

李佳蔚， 李龍， 張潮， 王繼納， 戎瑞明*

復旦大學附屬中山醫院泌尿外科, 上海200032

[摘要]目的： 探討組蛋白甲基化抑制劑DZNep在小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型中對腎臟的早期保護作用。方法： 18只C57BL/6小鼠隨機分成假手術組(sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)和缺血再灌注+治療組(IR+DZNep組)。后兩組建立缺血再灌注損傷模型，IR+DZNep組雙側腹股溝皮下注射DZNep(1 mg/kg)100 μL。假手術組游離雙側腎蒂但不阻斷。術后36 h采集標本，評價腎功能和腎組織病理學損傷；通過脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測腎小管上皮細胞凋亡情況；通過檢測髓過氧化物酶(MPO)評價炎癥細胞的浸潤程度；采用實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測腎臟組織相關炎癥細胞因子水平。結果： 腎臟缺血再灌注損傷后36 h，與IR組相連，IR+DZNep組小鼠血肌酐和尿素氮水平明顯下降(69.17±3.49 vs 103.83±14.62， 9.56±1.07 vs 0.75±15.83； P<0.05)；病理損傷減輕，腎小管細胞凋亡減少，炎癥細胞因子水平降低(P<0.05)。結論： DZNep可以通過抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應等方式降低小鼠缺血再灌注損傷腎臟的損傷程度，發揮對腎臟的保護作用。

[關鍵詞]DZNep；表觀遺傳修飾；腎臟；缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是導致腎移植術后腎臟功能損失的主要原因，可以引起一系列的病理現象，包括腎臟的炎癥反應以及腎臟纖維化，最終導致移植腎功能缺失或產生急性和慢性排斥反應，影響患者的生存質量[1-5]。近年來，對于腎臟的缺血再灌注損傷進行了多項研究，發現在損傷過程中，固有免疫系統和適應性免疫系統均起很大作用，免疫系統的激活使炎癥因子在移植物中大量富集，介導移植物的損傷[6-8]。

DZNep(3-deazaneplanocin A)是一種組蛋白甲基化抑制劑，既往常用于血液疾病的治療，在腎移植過程中的作用尚不明確[9]。近年已有實驗[10-11]表明，DZNep在小鼠的腎臟移植模型和骨髓移植模型中，均表現對移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的抑制作用，而對于腎臟缺血再灌注損傷的作用尚不明確。本實驗擬在小鼠腎移植缺血再灌注模型中，研究DZNep是否對損傷早期腎臟起保護作用，以期為臨床治療提供理論基礎。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑SPF級C57BL/6雄性小鼠18只，體質量20～25 g，8～10周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養于復旦大學附屬中山醫院動物房。DZNep粉劑由美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)提供，用無菌PBS溶解，儲存在-20℃冰箱，備用。

1.2實驗分組及處理18只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)、缺血再灌注+治療組(IR+DZNep組)，每組6只。小鼠腎臟IRI模型的建立：IR組、IR+DZNep組小鼠術前禁食8 h、禁水4 h，用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，行腹正中切口，游離雙側腎蒂，用無創血管夾阻斷雙側腎蒂30 min后復通。假手術組游離雙側腎蒂但不阻斷。治療組小鼠于術前2 d、術前1 d、開放灌注后和術后1 d共4個時間點給予100 μL DZNep(1 mg/kg)雙側腹股溝區皮下輪流注射。各組小鼠于術后36 h處死并采集血液、脾臟和腎臟標本。

1.3檢測方法將取得的小鼠血液在室溫下靜置30 min后，于4 400 r/min離心20 min，取上層血清，應用日立全自動生化分析儀檢測各組血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。

用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin ,H-E)染色后檢測腎臟病理學的變化。將腎臟標本固定、包埋、切片后行常規H-E染色，隨機選擇10個視野(100×)進行評分，以評估組織病理學變化。

通過檢測脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxy nucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)腎小管上皮細胞凋亡情況。通過檢測髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)，評價中性粒細胞的浸潤程度。采用DAB染色法，以細胞核染褐黃色為陽性細胞，隨機選取10個高倍視野(400×)，計平均數為陽性細胞數。

TRIzol法提取小鼠腎臟總mRNA，反轉錄為cDNA，用TaqMan探針方法行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測腎臟組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、白介素6和10(IL-6、IL-10)水平。

2結果

2.1DZNep對小鼠缺血再灌注損傷腎臟功能的影響結果(圖1)表明：在小鼠腎臟缺血再灌注損傷后36 h，IR組Scr水平高于sham組[(103.83±14.62) μmol/Lvs(77.5±14.27) μmol/L，P=0.010 198]，BUN水平明顯高于sham組[(30.75±15.83) mmol/Lvs(6.63±0.84) mmol/L,P=0.003 931]；IR+DZNep組Scr水平明顯低于IR組[(69.17±3.49) μmol/Lvs(103.83±14.62) μmol/L，P=0.000 213]，BUN水平明顯低于IR組[(9.56±1.07) mmol/Lvs(30.75±15.83) mmol/L，P=0.008 417]。

圖1　腎臟缺血再灌注損傷后36 h小鼠血肌酐和尿素氮水平

2.2DZNep對小鼠缺血再灌注損傷腎臟組織形態學的影響結果(圖2)表明：sham組腎單位和腎間質的結構基本正常。IR組小鼠腎臟組織充血水腫，腎小管結構破壞消失，上皮細胞腫脹、脫落；腎小管擴張、管腔堵塞，見大量蛋白管型、顆粒樣管型及紅細胞管型，伴有腎實質和間質出血以及大量炎癥細胞浸潤。IR+DZNep組腎單位和腎間質結構和形態較為完整，腎臟組織損傷程度及范圍較IR組明顯減輕，H-E評分差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3DZNep對小鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎小管細胞凋亡的影響結果(圖3)表明：IR組TUNEL陽性細胞明顯多于sham組，說明IR可引起腎小管細胞的凋亡；IR+DZNep組TUNEL陽性細胞數明顯少于IR組，說明DZNep能抑制凋亡。3組TUNEL陽性細胞數差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2　H-E病理染色及評分

圖3　TUNEL檢測結果及陽性細胞計數

2.4DZNep對小鼠腎臟缺血再灌注損傷后中性粒細胞浸潤的影響結果(圖4)表明：IR組MPO陽性細胞明顯多于sham組，說明IR可誘導中性粒細胞浸潤；IR+DZNep組陽性細胞數明顯少于IR組，說明DZNep明顯抑制中性粒細胞浸潤。3組陽性細胞數差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5DZNep對腎臟組織炎癥細胞因子表達的影響再灌注后36 h，與sham組相比，IR組和IR+DZNep組炎癥細胞因子的表達均升高；與IR組相比，IR+DZNep組相關炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10)的表達均明顯降低(P<0.05，圖5)。

圖4　MPO檢測結果及陽性細胞計數

圖5　各組小鼠腎組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α mRNA的表達水平

3討論

缺血再灌注損傷常影響移植后的器官功能恢復，導致急性或慢性排斥反應，進而影響移植物的狀態及患者的長期存活[1]。表觀遺傳學修飾是指在不改變DNA序列的情況下對基因表達及調控進行的一種可遺傳修飾。常見的表觀遺傳學修飾方式有DNA甲基化、組蛋白修飾以及染色體重塑等方式[12-13]。近年來，表觀遺傳學修飾在腎臟移植過程中的重要性已逐漸凸顯出來，目前已證實表觀遺傳學改變與移植腎損傷以及移植后相關疾病的發生有一定的聯系[14-15]。

DZNep是一種組蛋白甲基化抑制劑，既往常用于血液學疾病的治療。在小鼠中，DZNep可用于治療白血病、膠質瘤等，并且由于其改變基因具有可逆性，目前已成為一種理想的改變表觀遺傳學的藥物[9]。已有研究[10-11]表明，DZNep在腎臟移植模型和骨髓移植模型中，均表現對GVHD的抑制作用，且可以預防供體源性CD8+T細胞介導的GVHD的發生，對移植后的腎臟起明顯的保護作用。本研究中，在小鼠腎臟缺血再灌注術后36 h，DZNep可以顯著降低Scr和BUN；腎臟病理結果證實，DZNep在腎臟缺血再灌注損傷中起保護作用；TUNEL和MPO染色表明，DZNep在缺血再灌注損傷中能抗腎小管細胞凋亡，進而維持腎小管結構與功能完整。在缺血再灌注損傷的過程中，受損的上皮細胞會分泌炎癥細胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10等。這些炎性因子導致損傷部位形成局部炎性環境，介導相關炎性反應、活化淋巴細胞，進而加重損傷[1-2]。本研究中，DZNep使缺血再灌注損傷小鼠各炎性因子的表達降低，進一步說明DZNep對腎臟有明顯的保護作用。

綜上所述，DZNep能通過抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應降低小鼠缺血再灌注損傷腎臟的損傷程度，保護腎臟功能。本研究為腎臟移植后藥物的應用提供了新思路，也為DZNep在移植術中的應用提供了動物實驗基礎，但是關于DZNep對腎臟保護作用的具體機制仍有待進一步的研究探討。

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[本文編輯]姬靜芳

[收稿日期]2016-03-01[接受日期]2016-06-06

[作者簡介]李佳蔚, 碩士生. E-mail: jwli15@fudan.edu.cn *通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: rong.ruiming@zs-hospital.sh.cn

[中圖分類號]R 692

[文獻標志碼]A

Protective effect of histone methylation inhibitor DZNep on kindey in ischemia reperfusion injury of kidney transplantation in mice

LI Jia-wei, LI Long, ZHANG Chao, WANG Ji-na, RONG Rui-ming*

Department of Urology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai200032, China

[Abstract]Objective： To study the protective effect of histone methylation inhibitor DZNep on kidney at early stage in the model of renal ischemia reperfusion injury in mice. Methods： 18 C57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group (sham group), ischemia reperfusion injury group (IR group) and ischemia reperfusion plus therapy group (IR+DZNep group). The model of ischemia reperfusion injury was established in the latter two groups. The IR+DZNep group was given bilateral inguinal subcutaneous injection of DZNep (100 μL per mg/kg). Bilateral renal pedicles were isolated but not clamped. Renal function and histopathological changes were evaluated 36 h after operation. The apoptosis of renal tubular epithelial cells was detected by TDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. Infiltration of inflammatory cells was evaluated through the detection of myeloperoxidase (MPO). Inflammatory cytokine levels in renal tissue were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results： After DZNep treatment, the serum creatinine and urea nitrogen level decreased when compared with IR group (69.17±3.49 vs 103.83±14.62, 9.56±1.07 vs 30.75±15.83; P<0.05). Apoptotic renal cells in DZNep group also declined than IR group(P<0.05). Conclusions： DZNep can reduce the degree of renal ischemia reperfusion injury in mice by inhibiting cell apoptosis and reducing inflammatory reaction, and play a role in protecting the kidney.

[Key Words]DZNep; epigenetic modification; kidney; ischemia reperfusion injury