納米氧化石墨烯控釋載藥體系研究現狀

錢文昊， 蘇儉生

1.上海市牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫學院口腔修復學教研室，上海　200072 2.上海市徐匯區牙病防治所，上海　200032

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·綜述·

納米氧化石墨烯控釋載藥體系研究現狀

錢文昊1,2， 蘇儉生1*

1.上海市牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫學院口腔修復學教研室，上海200072 2.上海市徐匯區牙病防治所，上海200032

[摘要]納米氧化石墨烯(NGO)具有生物相容性好、抗菌、促進干細胞成骨分化等特性，有望作為一種新型的涂層材料應用于疾病預防和治療，因此是目前研究的熱點之一。本文綜述了近年來NGO用于載藥及其生物安全性方面的研究進展。

[關鍵詞]納米氧化石墨烯；涂層；載藥

石墨烯(graphene)于2004年由英國曼徹斯特大學Geim和Novoselov研究小組發現。石墨烯是由碳原子以sp2雜化連接的單層，厚度僅0.35 nm，是世界上最薄的新型二維納米材料。石墨烯優異的電學、力學和熱學性質使其成為復合材料、傳感器、能源等領域研究的熱點[1]。納米氧化石墨烯(nano-graphene oxide，NGO)具有大的比表面積，并且其2個基面都可用來負載藥物，可以與芳香環類藥物通過較強的物理吸附作用非共價結合。NGO能運輸多種水溶性較差的藥物，對大部分難溶性藥物的轉運具有重要意義。NGO具有生物相容性好、抗菌、促進干細胞成骨分化等特性，是目前研究的熱點之一。本文綜述了近年來NGO在載藥及其生物安全性方面的最新研究進展。

1NGO的腫瘤靶向藥物傳遞潛能及抗菌效能研究

NGO通過化學方法氧化天然石墨而得到，結構與石墨烯基本相同，僅在由碳原子構成的二維空間無限延伸的平面上連有-OH、-COOH、-O-、C=O等含氧官能團。這些功能性基團賦予氧化石墨烯(graphene oxide，GO)分散性、親水性等特性，同時有利于化學功能化修飾接枝不同的化合物(或共價負載藥物)，在生物醫學領域表現出很大的應用潛力[2]。NGO具有較強的增強滯留與滲透(enhanced permeability and retention，EPR)效應和腫瘤被動靶向性[3]。sp2雜化碳原子使NGO具有高比表面積和大π共軛結構，其兩面都可通過共價、非共價作用與藥物結合，因此藥物負荷量較高。此外，NGO制備簡便、成本低[4]。總之，NGO具有多重優勢，是腫瘤靶向藥物傳遞潛在的理想納米載體材料。

目前，GO作為納米藥物傳輸載體的研究[5-15]已經很多。Yun等[16]通過改變連接碳鏈的長度，合成一系列不同的銀納米粒子修飾石墨烯的復合材料(GO-Cx-Ag，HS-(CH2)x-SH﹦Cx，x﹦0、2、4)，見圖1。該研究中，透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)和X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)顯示，GO-C2-Ag中銀納米粒子粒徑最小且能均勻負載在石墨烯片層表面上；抗菌試驗表明，對鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，GO-C2-Ag比GO-C0-Ag和GO-C4-Ag表現出更強的抗菌性能。

圖1　GO-CX-Ag合成示意圖(x﹦0、2、4)

Li等[17]設計了1種用胍基聚合物(polyhexa-

methylene guanidine hydrochloride，PHGC)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)共修飾GO(GO-PEG-PHGC)的簡便方法(圖2)。結果顯示，GO-PEG-PHGC對大腸桿菌(Escherichiacoli)和Staphylococcusaureus均表現出很好的抗菌效果；同GO、GO-PEG和GO-PHGC相比，GO-PEG-PHGC具有更好的抗菌效果，提示PEG使GO-PEG-PHGC具有更好的分散性。

Huang等[18]通過在聚乳酸中添加一定質量分數的負載氧化鋅納米粒子的GO，制備出1種新型納米復合材料薄膜。該薄膜具有較強的機械強度、抗紫外線和抗菌性能，在光照條件下抗菌率尤其高，可達97%。Chen等[19]采用十六烷基三甲基溴化銨輔助的水熱合成法，合成由鎢酸鉍(bismuth tungstate，Bi2WO6)與GO組成的層狀納米復合材料(BWO/GO)，見圖3。該復合材料除了具有較強的吸附能力和較高的光催化性能外，在可見光照射條件下還表現極好的抗菌效果。BWO/GO受到光照時產生的氧自由基能有效破壞細菌的細胞結構使其增殖終止，從而達到抗菌效果。

圖2　GO-PEG-PHGC的合成示意圖

Zhang等[20]通過原位同時還原GO和銀離子一步法制備出銀米粒子修飾的石墨烯片層，再通過熱驅動自組裝得到石墨烯/銀納米粒子雜化材料薄膜(RGO/AgNP hybrid film)。該薄膜具有很高的抗菌活性和生物相容性。同銀納米粒子相比，該雜化材料中銀納米粒子得到充分均勻的分散，提高了銀納米粒子同細菌接觸的有效面積，從而有效提高其抗菌能力。Qi等[21]則將還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)與硼摻雜金剛石(boron-doped diamond，BDD)陽極一同用于三電極電化學氧化體系(圖4)，發現兩者具有很好的協同抗菌效果。其通過TEM觀測不同條件下大腸桿菌的形態后認為，rGO片層具有萃取細菌細胞膜上磷脂使其失活進而刺穿細胞膜的作用，而BDD則能在電解過程中腐蝕細菌的細胞膜，由此，兩者發揮協同抗菌作用。

He等[22]研究發現，GO對引起牙科疾病的病原體有很好的殺滅效果，用GO的水溶液對變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、具核梭桿菌(Fusobacterium

nucleatum)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)進行處理，結果表明，當GO濃度高時，其殺菌效果也提高；用TEM對病原體進行觀測，發現細菌的細胞壁和細胞膜GO納米片層破壞，細胞質外泄。故其認為在牙科臨床治療中，GO是一種非常有應用前景的滅菌材料。Shahnawaz Khan等[23]在同1只小鼠背部皮膚同時制造3個傷口并用Staphylococcusaureus進行感染，發現同時用近紅外激光熱療和GO處理的傷口愈合速度和愈合效果優于兩者單獨應用，說明兩者具有良好的協同抗菌效果。

圖3　BWO/GO納米復合材料的設計

圖4　BDD-rGO抗菌機制示意圖

A：促進大腸桿菌向rGO表面遷移；B：大腸桿菌3個死亡機制，a：電荷轉移；b：細胞膜被rGO鋒利的邊緣破壞；c：被·OH氧化

2NGO作為藥物載體的生物安全性研究

作為醫藥載體的石墨烯及其衍生物應用于臨床的生物安全性十分關鍵[24]。目前已有大量的實驗在細胞水平，包括細菌、不同類型人源細胞系(肺上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、神經細胞等)，對其毒性進行評價，結果顯示，石墨烯和GO可能通過破壞細胞質膜、產生超氧、誘導凋亡等破壞細胞。但是，研究表明，表面被PEG[5-8]、殼聚糖[9]、透明質酸[10]等多聚物修飾、功能化的GO幾乎沒有細胞毒性。

石墨烯及其衍生物在體的內毒性研究得到與細胞毒性分析相似的結果。用188Re標記無修飾的NGO經靜脈注射后主要在肺部組織長時間滯留[11,25]，引起肺組織炎癥反應[12]；但表面適當的功能化，如PEG、葡聚糖(dextran，DEX)或羧基化等可提高石墨烯的生物相容性，而消除石墨烯引起的的不良反應[13-15,26]。例如，PEG修飾的GO在生理環境中的穩定性較好，靜脈注射后未引起小鼠明顯不良反應，發現其在網狀內皮系統和肺組織的蓄積減少；而在無靶肽段存在的情況下，腫瘤被動靶向效果明顯增加[13]。用125I標記的NGO-PEG和NGO-DEX經靜脈注射后早期在肝、腎等器官短暫蓄積，隨后逐漸經尿和大便排泄[13,15]。上述研究為NGO功能化修飾的必要性、在體內的生物安全性研究提供了依據。然而，目前NGO及表面修飾后的衍生物與機體各系統之間的相互關系仍不明確，如何優化功能化修飾并確保復合體的腫瘤靶向富集依然值得探討。

Matsumura等[27]于1986年首次報道，67Ga標記的鐵轉運蛋白在實體瘤組織具有被動富集的EPR效應。腫瘤細胞屬于無序生長，腫瘤組織內部非常致密，壓力也隨著深度越來越大，因此，一般的藥物傳輸系統只能在腫瘤表面起作用，很難深入腫瘤組織內部發揮療效；而50～200 nm的脂質體、高分子材料、納米粒子對腫瘤組織具有EPR效應，可滲入到腫瘤組織內部并聚集，具有被動靶向性，這一原則也被作為高分子和納米藥物制劑研制的首要準則[3,28]。NGO具有石墨烯的特有性質，比如單個原子厚度、大型二維平面結構、穩定、大小可控制(50～200 nm)，且具有較強的EPR效應和腫瘤被動靶向性[29]。

3總結和展望

當前的NGO體系主要是通過非共價物理吸附載藥，載藥量不穩定，在體內的載藥穩定性更值得探討；而在腫瘤被動靶向性基礎上增加主動靶向也應成為NGO研究的重點。葉酸受體在多種細胞表面高表達，而葉酸具有病灶主動靶向能力，能夠提高納米材料的靶向性。因此，可用葉酸對NGO進行生物靶向基團修飾，使其具有更強的靶向性。此外，通過優化NGO的大小、PEG的接入量等條件，進一步改善NGO體系的體內行為，最大程度地降低在正常組織的滯留，以期為病灶靶向治療提供理想的NGO藥物載體。總之，石墨烯及其衍生物在納米生物醫學領域的應用前景良好，但作為病灶靶向制劑載體的研究仍處于探索階段，還需要進一步提高其生物相容性、安全性。

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[本文編輯]姬靜芳

[收稿日期]2016-01-13[接受日期]2016-05-08

[基金項目]國家自然科學基金(81371949、81572114),上海市生物醫藥科技重點項目(13411951200). Supported by the National Natural Science Foundation of China ( 81371949, 81572114) and Shanghai Scientific Technological Innovation Project (13411951200).

[作者簡介]錢文昊, 博士生, 副主任醫師. E-mail: pingyanlaoto@163.com *通信作者(Corresponding author). Tel: 021-56032686, E-mail: sjs@tongji.edu.cn。

[中圖分類號]R 988.2

[文獻標志碼]A

Research status of controlled release drug delivery system of nano graphene oxide

QIAN Wen-hao1,2, SU Jian-sheng1*

1. Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, Tongji University, Shanghai200072, China 2. Shanghai Xuhui District Dental Center, Shanghai200032, China

[Abstract]Nano graphene oxide (NGO) has the characteristics of good biocompatibility, antibacterial activity, and promoting the osteogenic differentiation of stem cells. As a new type of coating material it is expected to be used in the prevention and treatment of diseases, so it is one of the hot spots in present study. This paper summarizes the latest research progress of NGO application in drug delivery and its biological safety.

[Key Words]nano graphene oxide; coating; drug delivery