腐皮鐮刀菌對不同品種核桃抗性生理指標的影響

鄭　磊， 張　靜， 麻文建， 彭　燕， 朱天輝

( 四川農業大學 林學院， 四川 雅安 625014 )

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腐皮鐮刀菌對不同品種核桃抗性生理指標的影響

鄭磊， 張靜， 麻文建， 彭燕， 朱天輝*

( 四川農業大學 林學院， 四川 雅安 625014 )

摘要：為分析腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)引起的核桃根腐病對寄主抗性生理指標的影響，該研究以鐵核桃、綿陽早熟、新疆2號3個核桃品種為材料，研究各品種受腐皮鐮刀菌侵染后，不同時期的發病情況以及丙二醛(MDA)、可溶性糖含量以及過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的動態變化。結果表明：接種病原菌50 d后，鐵核桃100%發病，屬高感品種，綿陽早熟和新疆2號發病率分別為23.33%和16.67%，屬抗病品種；在50 d監測范圍內，各品種對照組各項葉部生理指標僅出現上下波動且差異不顯著；然而，各品種核桃接入腐皮鐮刀菌后，可溶性糖含量隨時間迅速下降，MDA含量和POD活性總體表現為先上升趨勢，SOD、PPO活性總體則表現為先上升后下降的變化趨勢，并且5個指標品種間差異顯著，而CAT活性變化無規律。相關性分析表明，可溶性糖、MDA含量、SOD、POD、PPO活性可以作為核桃品種抗性評價指標。該研究結果為深入研究由腐皮鐮刀菌引起的核桃根腐病發病機制以及通過誘導等措施提高其抗性的研究提供了理論基礎。

關鍵詞：根腐病, 腐皮鐮刀菌, 核桃, 抗性生理指標

核桃(Juglansregia)屬于胡桃科(Juglandaceae)植物，與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果(余旋等，2012)，也是我國重要的經濟林樹種之一(武曉霞，2013)，其樹體高大，能防風固沙，樹皮枝葉及外果皮有很高的藥用價值，特別是果實獨特的營養保健價值(Grief et al,2007)，長期以來受到人們的喜愛。隨著核桃的種植面積越來越大，其病害發生也呈逐年上升的趨勢。作者于2013年4月在涼山州木里縣鐵核桃(J.sigllata)種植區內發現腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)可引起大面積鐵核桃根腐病的發生，受到病原菌侵染的植株出現葉片干枯，枝條死亡，甚至有些2～3年生植株死亡，使得鐵核桃大量減產，造成嚴重經濟損失，但這種現象品種間差異顯著，可能與核桃某些生理代謝有聯系。

丙二醛、可溶性糖等抗性物質以及超氧化歧化酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等防御酶類，與植物的病害抗性能力存在相關性(Mullet et al，1990；王國莉，2008；韓珊和朱天輝，2009；Liu et al，2011；李姝江等，2012；Debona et al，2012)。研究寄主植物受到病原侵染后的生理生化變化，對進一步揭示病原致病機制，植物的抗性遺傳基礎和抗病基因的表達方式及表達過程有重要意義。本研究選取鐵核桃、新疆2號及綿陽早熟3個核桃品種為材料，研究接種腐皮鐮刀菌后各核桃品種的發病情況，以及不同時期的可溶性糖、丙二醛含量和上述防御酶類活性的變化情況，分析腐皮鐮刀菌侵染后核桃的相關生理指標的變化規律以及與品種抗性之間的相關性，以期為核桃進一步抗病育種提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種：腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，分離自涼山州木里縣鐵核桃桃根內，由四川農業大學森林保護重點實驗室提供。供試植株：3年生鐵核桃、新疆2號、綿陽早熟實生苗，由四川省雅安市石棉縣核桃育種基地提供。

1.2 菌液的制備及侵染

腐皮鐮刀菌孢懸液：將已活化的腐皮鐮刀菌接種于新鮮PDA平板上，25 ℃培養5～7 d，收集分生孢子，用無菌水稀釋成3×105cfu·mL-1濃度，制成孢懸液待用。腐皮鐮刀菌對核桃侵染：選取健康、無病害、長勢相同的鐵核桃、新疆2號、綿陽早熟實生苗各40株，盆栽于直徑40 cm塑料盆內，生長2周后，各選取30株統一采用根部創傷法與灌根接種法(周林等，2010)相結合，將配制好的病原菌孢懸液侵染核桃，同時選取10株分別以灌等量無菌水的處理作為對照。葉片采集：分別于0、10、20、30、40、50 d時，對各組處理植株采集5 g葉片，液氮速凍后，帶回實驗室保存于-80 ℃冰箱內。

1.3 粗酶液的提取

粗酶液提取參照童蘊慧等(2004)的方法(略有改動)：1.0 g核桃葉片，加適量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和少量石英砂以及10 mL 0.5 mol·L-1pH6.8磷酸緩沖液在研缽中冰浴研磨成勻漿，轉入10 mL離心管，旋渦震蕩1 min，4 ℃、6 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.4 指標檢測及方法

可溶性糖(Soluble sugar)含量的測定采用蒽酮比色法、丙二醛(Malondialdehyde， MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸 (Thiobarbituric acid， TBA)法測定、超氧化歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的測定采用淡藍四唑(Nitro-blue tetrazolium，NBT)光還原法、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase， PPO)采用鄰苯二酚法、過氧化氫酶(Catalase，CAT)采用紫外吸收法、 過氧化物酶(Peroxidase，POD) 采用愈創木酚法(童蘊慧等，2004)。各項生理指標的測定均進行3次重復。

表 1　不同品種核桃接菌處理后的發病情況

注：不同小寫字母表示品種間差異顯著；不同大寫字母表示不同時間差異顯著(LSD法，P< 0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences among different cultivars determined by LSD test (P<0.05)； Different capital letters indicate significant differences among different treatment times determined by LSD test (P<0.05).

圖 1　不同品種核桃葉部可溶性糖和丙二醛含量變化動態1. 鐵核桃； CK 1. 鐵核桃對照； 2. 綿陽核桃； CK 2. 綿陽核桃對照； 3. 新疆核桃； CK 3. 新疆核桃對照。下同。Fig. 1　Dynamic responses of soluble sugar and MDA content in different walnut varieties　1. Juglans sigllata; CK 1. Control of J. sigllata; 2. Mianyang walnut; CK 2. Control of Mianyang walnut; 3. Xinjiang walnut. CK 3. Control of Xinjiang walnut. The same below.

圖 2　不同品種核桃葉部酶活性變化動態Fig. 2　Dynamic responses of enzyme activity different walnut varieties

1.5 數據分析

數據采用EXCEL 2010和SPSS 19.0軟件分析處理，用LSD法做多重比較(P<0.05，P<0.01)。

2結果與分析

2.1 腐皮鐮刀菌侵染核桃發病情況

對實驗期間的各組處理的120株核桃植株發病情況進行調查，從表1可發現，綿陽早熟和新疆2號從第30天開始發病，50 d后，發病率分別為23.33%和16.67%，并且在調查過程中發現，兩品種核桃發病情況較輕，只是處于病情級數1級階段，表現為抗病品種，且新疆2號抗性最高；而鐵核桃10 d時開始就出現發病現象，30 d時發病率達到63.33%，且個別植株出現死亡現象，50 d后表現為全部發病，屬于腐皮鐮刀菌的高感品種。

在取樣過程中，發現綿陽早熟和新疆2號品種的根系比鐵核桃發達，其中有些經過侵染處理的植株較對照組長勢更為良好，這可能與品種的抗病反應有關。

2.2 腐皮鐮刀菌對3種核桃MDA和可溶性糖含量的影響

不同品種核桃接種腐皮鐮刀菌處理后葉片MDA含量變化如圖1。從圖1可以發現，各品種對照組葉片MDA含量接種前后無顯著差異(P>0.05)；接種后，腐皮鐮刀菌導致鐵核桃葉片內MDA含量迅速上升，50 d后達到最大值17.61 mmol·g-1FW，是對照的3.4倍且存在極顯著差異(P<0.01)；而綿陽早熟、新疆2號則是先下降，20 d后開始逐漸迅速上升，50 d后達到峰值且與接種前存在極顯著性差異(P<0.01)；50 d時，各品種葉片MDA含量存在顯著差異(P<0.05)，新疆2號>綿陽早熟>鐵核桃。

不同品種核桃接種腐皮鐮刀菌處理后葉片可溶性糖含量變化如圖1。從圖1可以發現，各品種對照組葉片可溶性糖含量接種前后無顯著差異(P>0.05)；然而，綿陽早熟和新疆2號各時期均大于鐵核桃，且差異顯著(P<0.05)。接種后，鐵核桃葉片內可溶性糖含量迅速下降，且在整個測試時期均呈現顯著下降趨勢(P<0.05)，50 d后達到最小值46.75 mg·kg-1；而綿陽早熟、新疆2號核桃與鐵核桃葉片可溶性糖含量差異性顯著，且下降趨勢較為緩慢，在20 d時出現較為明顯的回升。可溶性糖含量為鐵核桃<綿陽早熟<新疆2號。

2.3 腐皮鐮刀菌對3種核桃葉部防御酶活性的影響

2.3.1 SOD活性不同品種核桃接種腐皮鐮刀菌處理后葉片SOD活性變化如圖2，3種核桃的對照組葉片SOD活性隨時間變化不大，而接種病原菌后，鐵核桃、綿陽早熟、新疆2號變化趨勢不同。如圖2所示，接種病原菌后鐵核桃SOD活性隨時間上升，30 d時達到峰值，之后迅速下降，50 d后下降至50.80 U·g-1FW且低于對照組64.48 U·g-1FW，綿陽早熟則是接種后SOD活性急速上升，20 d時達到峰值165.42 U·g-1FW，之后有所下降但保持在較高的水平，新疆2號SOD活性接種后急速上升，20 d達到峰值182.42 U·g-1FW，之后略有下降40 d后達到第二個峰值168.56 U·g-1FW。通過方差分析SOD活性峰值：鐵核桃<綿陽早熟<新疆2號存在顯著性差異(P<0.05)，且50 d時鐵核桃與后兩者差異極顯著(P<0.01)。

2.4.2 POD活性不同品種核桃接種腐皮鐮刀菌處理后葉片POD活性變化如圖2， 3種核桃的對照組葉片POD活性隨時間變化不大。接種腐皮鐮刀菌后， 三種核桃的POD活性隨著時間的變化趨勢大致相同，均是保持上升趨勢，然而， 鐵核桃與其對照組葉片POD活性顯著小于綿陽早熟、新疆2號和其對照組(P<0.05)，并且在接種腐皮鐮刀菌后整個時期POD活性也表現出此差異。葉片POD活性：鐵核桃<綿陽早熟<新疆2號， 經方差分析發現各品種間存在顯著性差異(P<0.05)。

表 2　生理指標、發病率、處理時間、品種抗性之間的相關性

注：*. 表示各生理指標與時間、抗性和感病指數呈顯著相關(P<0.05，LSD測驗)；**. 表示各生理指標與時間抗性和感病指數呈極顯著相關(P< 0.01，LSD測驗)。

Note: *. Significant correlation among physiological index, time, resistance and incidence atP<0.05 using LSD test; **. Remarkably significant correlation atP<0.01 using LSD test.

2.3.3 PPO活性不同品種核桃接種病原菌腐皮鐮刀菌處理后葉片PPO活性變化如圖2，3種核桃的對照組葉片PPO活性隨時間變化不大，接種病原菌后 ，3種核桃變化趨勢大致相同且都呈現先上升后下降趨勢，綿陽早熟、新疆2號接種20 d后達到峰值，分別是對照組的2.32和2.52倍，隨后開始下降，但仍然保持相比與對照組較高的水平，各時期與對照組差異性顯著(P<0.05)，鐵核桃30 d時達到峰值133.77，之后迅速下降。50 d時PPO活性：鐵核桃<綿陽早熟<新疆2號，且存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3.4 CAT活性不同品種核桃接種腐皮鐮刀菌處理后葉片CAT活性變化如圖2，3種核桃的對照組CAT活性隨時間變化不大。接種腐皮鐮刀菌后，三種核桃的CAT活性隨著時間的變化較大，但是各品種的葉片中CAT活性表現沒有規律且各品種間無顯著差異(P>0.05)

2.4 相關性分析

各項生理指標與接種時間、品種、發病率的相關性結果如表2所示。除CAT外其它各項生理指標與品種抗性的相關性均達到顯著或極顯著水平。具體來看，可溶性糖、丙二醛含量與時間、抗性、發病率相關性均達到極顯著水平。在4種防御酶活性中，SOD、POD、PPO活性與抗性均呈極顯著正相關關系，而與發病率呈顯著或極顯著負相關，但僅POD與時間存在顯著正相關關系，CAT與時間、品種抗性、發病率無顯著相關性。另外，發病率與時間呈極顯著正相關，與品種間抗性為顯著負相關。綜上所述，推測可溶性糖、丙二醛含量與SOD、POD、PPO活性可以作為核桃品種抗性評價指標。

3討論

腐皮鐮刀菌可引起多種經濟作物根腐病(Lozovaya et al, 2006；Koike et al，2011；Silva & Clark，2013；Cao et al，2013)，還可引起一些植物的果實腐爛，如甜辣椒果腐病(Ramdial et al，2010)。目前，腐皮鐮刀菌引起核桃根腐病還是首次被發現。當鐮刀菌侵害植株時，病原菌分泌毒素，破壞植株的細胞膜系統，最終導致細胞死亡和寄主死亡，與此同時，寄主植物自身也會表現出抵抗反應，主要包括形態和生理生化兩大方面。

目前，關于逆境脅迫影響核桃抗性生理生化特性的研究較多，如干旱脅迫、澇漬脅迫、酸雨脅迫以及UV-B輻射、一氧化氮處理等(郭其強等，2010；張往祥等，2011；相昆等，2007)對核桃生理生化的影響，但針對于病原菌的侵入對其生理生化特性的影響研究較少。筆者以腐皮鐮刀菌引起核桃根腐病為基礎，通過檢測鐵核桃、綿陽早熟、新疆2號三個品種接種后不同時間點的發病情況以及6個生理指標的變化情況，初步分析了腐皮鐮刀菌侵染后核桃發病情況和對核桃的生理生化變化及其抗病性關系。

本研究表明，接種腐皮鐮刀菌后，綿陽早熟和新疆2號屬抗感品種，而鐵核桃最終發病率達到100%，屬易感品種；本研究還表明，接種腐皮鐮刀菌后，各品種間葉片的可溶性糖含量、MDA含量、SOD酶活性、PPO酶活性、POD酶活性存在顯著差異(P<0.05)。可溶性糖在植物體內主要參與呼吸代謝或為合成保護性物質提供物質來源(韓珊等，2009)。從本研究結果看，接種腐皮鐮刀菌后，使鐵核桃可溶性糖含量降低，核桃組織結構被破壞，進而光合作用削弱，這僅印證了“病原菌可使寄主體內糖代謝紊亂”(Madsen & Hodges，1983)的結論，但新疆2號、綿陽早熟在接種20 d后可溶性糖含量有所增加，說明抗病品種在受腐皮鐮刀菌侵染后有一個合成保護性物質并提高生理強度的過程。MDA是細胞膜脂過氧化作用的產物，其含量與膜脂過氧化程度呈正相關關系(Resende et al，2012)。本研究發現，各品種葉片MDA含量存在顯著差異(P<0.05)，且新疆2號>綿陽早熟>鐵核桃，這與“丙二醛含量在接種病原菌后增長的速度和積累量決定植株的抗病能力”(李海燕等，2006)的結論相呼應。

致病真菌對林木植物抗性酶活性有顯著的影響(韓珊和朱天輝，2009)，但這種影響也會因病原、寄主不同而有所差異。含金屬離子的SOD在生物系統發育過程中的防御活性氧毒害起著重要的作用(Paczkowska et al，2007)，本研究表明，綿陽早熟、新疆2號核桃在接種病原菌后，SOD活性迅速升高，后略有降低但保持較高水平，鐵核桃則是升高后迅速下降低于對照組，說明抗性品種有很強的自我調節恢復能力，而鐵核桃感病嚴重使得酶系統出現混亂，這與植物在感病后SOD活性上升且抗病品種SOD酶活性持續較高水平狀態，感病品種后期則會降低至低于對照組(Liu et al，2011；李姝江等，2012)的規律一致，但董金皋等(1999)的研究表明SOD與抗病性呈現負相關。POD可參與植物體內多種代謝途徑，從而在抗病性中起重要作用，POD也可作為 SOD的補救體系，當后期SOD活性降低時，細胞內另一個清除超氧自由基的防御體系啟動，POD活性升高，阻止病害的侵入。但Filha et al(2011)發現植物在感病后期，植物體內POD活性越高則不利于抵抗病原的侵染。本研究表明SOD、POD酶活性與抗病性呈正相關關系，與Debona(2012)研究結果相吻合。PPO是氧化生物體內酚類物質的主要酶類，其氧化作用產生的醌類物質，如綠原酸、咖啡酸等，抑制病原菌毒素的產生或使毒素失活(房保海等，2004)，均是有效的殺菌物質，大量研究表明，病原菌侵染植物體后可引起PPO酶活性的升高(Retig et al，1974)，宋鳳鳴等(2001)發現鐮刀菌浸染植物體后，抗病品種PPO酶活性明顯高于感病品種，本研究發現，品種間PPO活性差異顯著，表明PPO酶活性與植物品種抗病性關系密切，可作為篩選抗根腐病品種的一項生理生化指標。 CAT廣泛存在于植物體內，可將H2O2還原生成H2O，然而CAT清除H2O2效率較低，所以許多研究對CAT活性變化是否與植物發病存在相關性結論差異較大。如 Resende et al(2012)研究表明CAT活性與其抗病性呈正相關性；潘汝謙等(1999)研究認為CAT活性與其抗病性呈負相關性；葛秀春等(2000)研究認為CAT活性與其抗病性無明顯關系；本研究表明，接種病原菌后各品種葉片CAT活性變化混亂無明顯規律，CAT酶活性與抗病性也無明顯相關性。造成此結果可能是當鐮刀菌侵害植株時，病原菌分泌毒素，破壞植株的細胞膜系統，導致CAT酶系統絮亂(Liu et al，2011)；另外，本研究還發現，綿陽早熟、新疆2號表現丙二醛、可溶性糖含量和酶活性的變化明顯早于鐵核桃，與Beckman(1990)的結果一致，抗病品種或感病品種受侵染后出現防衛反應的快慢和強度與品種康感性有關。

總之，核桃接種腐皮鐮刀菌后，對葉部可溶性糖、丙二醛含量和SOD、POD、PPO活性有顯著影響，結合3個不同核桃品種的糖代謝、丙二醛代謝和防御酶系的變化規律可以看出，本研究中涉及的生理指標(CAT除外)與核桃抗性之間相關性顯著，可溶性糖、丙二醛含量和SOD、POD、PPO活性均可用作核桃抗性品種的評價指標。

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Resistance physiological indexes of different walnut varieties after infected byFusariumsolani

ZHENG Lei, ZHANG Jing, MA Wen-Jian, PENG YAN, ZHU Tian-Hui*

(CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity， Ya’an 625014， China )

Abstract:Juglans sigllata, a commercial crop, is widely planted in Liangshan prefecture of Southwest China. Liangshan prefecture is a major traditional growing area of J. sigllata and has an unique advantage for walnut industrial development because of its good conditions of soil, solar-thermal and source of water. Currently there are 2.7 hm2 walnut, contributing to an important incomes for farmers. In April 2013, numerous J. sigllata were found infected with the root rot in the Muli County of Liangshan prefecture. Complications include dried leaves, dead brachces, and even death. According to the cultural characteristics, the fungus was primarily identified as Fusarium solani. To analyze the impact of host resistance physiological index of walnut root rot caused by F. solani, in this study, three different walnut varieties including Juglans sigllata, Mianyang walnut and No. 2 of Xinjiang walnut were the samples, and their morbidity situations and six changes of the physiological indexes including MDA, soluble sugar, POD, PPO, SOD and CAT were further detected after inoculated of Fusarium solani respectively. The results showed that the morbidity of Juglans sigllata was up to 100%, and the morbidities of Mianyang walnut and Xinjiang walnut were 23.33% and 16.67%, so it turned out that J. sigllata belonged to highly infected varieties, while the other two were disease-resistant varieties. During the fifty monitoring days, the leaf physiological indexes of the controls showed fluctuated and no obvious difference. But the content of soluble sugar of the experimental group droped rapidly over time, and the content of MDA and POD activities performanced rising trends overall, for SOD and PPO activities, it rose firstly and then droped. Moreover, the differences among the five Indexes of the study were significant while it was irregular to CAT activity. The correlation analysis indicated that the contents of soluble sugar and MDA, the activities of SOD, POD and PPO could be used as the standards to evaluate the resistance abilities of different walnut varieties. This paper provides important references to the study on mechanism of walnut root rot and improvement of resistance abilities.

Key words:root rot, Fusarium solani, walnut, resistance physiological index

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201409035

收稿日期:2014-09-16修回日期：2014-10-08

基金項目：國家科技基礎條件平臺項目(2005DK21207-13)[Supported by the National Science and Technology Basic Platform of China(2005DK21207-13)]。

作者簡介：鄭磊(1985-)，男，河南濮陽人，博士研究生，從事林木病理學研究，(E-mail)xiaoshitou4632@163.com。 *通訊作者：朱天輝，教授，博導，主要從事林木病理學研究，(E-mail)zhuth1227@126.com。

中圖分類號：Q945，S763.11

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)06-0651-07

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