TALEN構建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析

吳子環，胡雄兵3，毛鳳儀，王 超，張 彬，莊峰鋒3，胡克平，孫曉波，劉 曉，匡世煥，，金 文

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315000；2.中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心中藥（天然藥物）創新藥物研發北京市重點實驗室、中國醫學科學院-普渡大學脂肪代謝聯合實驗室，北京 100193；3.北京唯尚立德生物科技有限公司，北京 100085；4.普渡大學動物系，美國）

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TALEN構建Fndc5基因敲除小鼠及初步分析

吳子環1，2，胡雄兵3，毛鳳儀2，王 超4，張 彬2，莊峰鋒3，胡克平2，孫曉波2，劉 曉1，匡世煥2，4，金 文2

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315000；2.中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心中藥（天然藥物）創新藥物研發北京市重點實驗室、中國醫學科學院-普渡大學脂肪代謝聯合實驗室，北京 100193；3.北京唯尚立德生物科技有限公司，北京 100085；4.普渡大學動物系，美國）

【摘要】目的 通過構建Fndc5基因敲除小鼠，為后續的研究提供動物模型。方法 運用TALEN技術在Fndc5基因FNIII domain中造成缺失突變，并通過測序進行基因型鑒定。通過配對建立穩定遺傳系并在mRNA和DNA水平鑒定出生小鼠基因型；對不同年齡段出生小鼠進行體重、血糖分析；通過qPCR確定Fndc5在腎臟、肝臟、大腦、肌肉、心臟等組織中的表達情況。結果 成功構建并鑒定得到4種不同的Fndc5基因敲除小鼠品系；不同年齡段出生小鼠體重、血糖未見顯著性差異；確定Fndc5在肌肉、心臟等組織中高表達。結論 本實驗在國際上成功構建了Fndc5基因敲除小鼠，并進行了初步分析，為深入研究Fndc5基因在體內中的功能提供了動物模型。

【關鍵詞】骨骼肌；Fndc5基因；纖維連接蛋白；TALEN

骨骼肌在調控系統能量穩態上扮演著重要的角色。而且骨骼作為一個分泌器官漸漸被認同，肌肉分泌和表達的細胞因子和其他多肽類，并且通過自分泌、內分泌、旁分泌的方式在不同組織發揮作用的物質叫“肌因子”［1-3］。其中，肌因子 irisin越來越受到關注，其前體Fndc5（fibronectin type III domain containing protein 5）是一個跨膜蛋白，它的胞外域裂解產生一個溶解的激素irisin［4］。Fndc5最早是在對fibronectin type III domains的基因組搜索中發現的［5］。最初，研究發現Fndc5在運動的刺激下作為PGC1-α依賴的產物，隨后裂解產生irisin進入血液作用于白色脂肪，刺激UCP1表達提高產熱；促使白色脂肪棕色化，從而提高和改善了肥胖和糖尿病患者的代謝狀態，為治愈肥胖和糖尿病提供了可能［2］。隨著研究的深入，關于Fndc5的許多其他功能都被證實。

TALEN（transcriptionactivator-like（TAL）effector nuclease）靶向基因敲除基因修飾是第二代新型基因編輯分子生物學工具，首次發現于黃單胞桿菌（Xanthomonas）中［6，7］。TALE中的重復可變雙殘基（repeat variable di-residue，RVD）［6］與A、C、T、G有恒定的對應關系［8，9］。因此，為識別某一特定氨基酸序列，只需設計相應TALE單元串聯克隆，然后在N-端加上核定位信號，并在C-端融合上Fork I核酸內切酶的切割區，就構建成了TALEN［10，11］，利用其特異性內切酶活性切割特定的DNA序列，最后細胞可以通過NHEJ（non-homologous end joining）途徑修復DNA損傷，在此修復過程中隨機插入或刪除了一定數目的堿基，造成移碼突變，形成了目標基因敲除的突變體［12，13］。目前，TALEN技術已在非洲爪 蟾（XenoPuslaevis）［14，15］、青 鳉（Oryzias latiPes）［16］、斑馬魚（Danio rerio）［17］、大鼠（Rattus norvegicus）［18］、小鼠（Mus musculus）［19］等模式動物的基因敲除研究中獲得了成功。

Fndc5作為新肌因子irisin的前體從研究初始其在體內外的功能就備受熱議。它在小鼠、人體內的功能研究已經取得了初步進展，但是其在肌肉中的功能研究還未開展。我們通過TALEN技術在國

際上構建Fndc5基因敲除小鼠，并進行了初步分析，為后期研究Fndc5在體內尤其肌肉中的的功能提供了敲除小鼠模型，對于Fndc5/irisin對肌肉本身的影響的認識，將填補這一認知領域的空白。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57BL/6小鼠品系，購自北京維通利華有限公司，動物生產合格證號：SCXK（京）2014-0001。飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級動物房，實驗動物使用許可證：SYXK（京）2013-0023，動物房溫度（20～26）℃，相對濕度40%～70%。

1.1.2 TALEN質粒：TALEN質粒pCS5-eTALEN-T由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。靶位點位置 T1：TTTCTAGAAGAAGGATGT gcggatgctccggtt CATTCAGGAGGTGAACA，其中左邊TALE識別序列：TTCTAGAAGAAGGATGT 17 bp，右邊TALE識別序列：GTTCACCTCCTGAATG 16bp，間隔15 bp。靶 位 點 位 置T3：TCCGGCACCTCAAGGCC aactctgccgtggtcag CTGGGATGTCCTGGAGGA，其中左邊TALE識別序列：CCGGCACCTCAAGGCC 16 bp，右邊TALE識別序列：CCTCCAGGACATCCCAG 17 bp，間隔17 bp。

1.1.3 引物：對于靶點位置1，設計基因型檢測PCR引物：CATGTTTCCTTAGCTCTACTGTGG（正向），GGAGAAAGCATGCATGGCAGTCTC（反向）PCR片段長度為518 bp；對于靶點位置3，設計基因型檢測PCR 引 物：GGACCCTTGGTTTGGCCAGTCTA（正 向），CTCTACCATCATCCTCCATGCCTG（反向）PCR片段長度為 479 bp。Real-Time引物：FNDC5-F：ATGAA GGATGGGGAGGAA，FNDC5-R：GCGGCAGAAGAGAG CTATAACA，18s-F：CATGCAGAACC CACGACAGTA，18s-R：CCTCACGCAGCTTGTTG TCTA。

1.1.4 試劑：本實驗的引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。AmpPCRmix（TAKARA，Ro74A）試劑盒、TransZol Up Plus RNA Kit（Tran，ER501-01）、EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMxi（Tran，AE301-03）、TransStrt Top Green qPCR SupreMix（Tran，AQ131-02）、Base（堿液）、Neutrlization（中和液）等。

1.2 方法

1.2.1 Fndc5基因敲除TALEN靶點位置的設計：根據Fndc5的基因組結構，Fndc5 protein domain的分析，破壞the FNIII domain，將TALEN的靶點位置設計在外顯子3上或者外顯子3前，測定SSA活性，選擇活性比較高的靶點進行后續的Fndc5基因敲除小鼠的構建。

1.2.2 Fndc5基因敲除鼠的構建流程：將Fndc5-T1和 Fndc5-T3的 TALEN質粒對，體外轉錄成mRNA后，共顯微注射mRNA到小鼠的受精卵中，共注射120個受精卵，出生23只小鼠。兩周齡后，剪取4周齡出生小鼠任一只耳朵大約1/3，放置在做好標記的1.5 mL的離心管中，加入75 μL堿液（base）95℃以上40 min；然后加入75 μL中和液（neutrlization），常溫靜置5 min，溶液即為提取的基因組DNA。以此基因組DNA為模板進行PCR反應，產物測序并根據峰圖進行基因型鑒定。

2 結果

2.1 四品系Fndc5基因敲除小鼠的建立

2.1.1 Fndc5基因敲除TALEN靶點位置的設計：根據Fndc5的基因組結構，Fndc5 protein domain的分析，決定破壞the FNIII domain，因此TALEN的靶點位置將設計在外顯子3上或者外顯子3前，設計結果如圖1箭頭所示。

2.1.2 Fndc5 TALEN的SSA活性檢測：根據SSA活性結果，我們選擇活性比較高的靶點Fndc5-T1和Fndc5-T3進行后續的Fndc5基因敲除小鼠的構建，結果見圖2。

2.1.3 Fndc5基因敲除首建鼠的鑒定：將受精卵注射后出生23只小鼠，對出生兩周的小鼠進行基因型分析和鑒定。結果如圖3所示，我們選取Founder 7 （T1一條缺失2 bp，一條缺失4 bp）進行測序圖分析。測序峰形圖在突變位點開始出現雙峰，表明為雜合子。通過峰形分析，可以將突變型1的DNA序列（下指箭頭所指峰形）和突變型2的DNA序列（上指箭頭所指峰形）分析出來。結果為一條在CCGGTTCATTCAGGA前缺失2個堿基CT；一條在CGGTTCATTCAGG前缺失4個堿基GCTC，均發生移碼突變。

注：A為FNDC5蛋白質的一級結構，B為Fndc5基因組結構（箭頭為TALEN的靶點位置）。圖1 FNDC5蛋白質一級結構及Fndc5的基因組Note.A is the primary structure of FNDC5 protein；B is the Fndc5 genome structure（red arrow for TALEN target site）.Fig.1 The primary structure of FNDC5 protein and the Fndc5 genome.

2.1.2 F1代四品系Fndc5基因敲除鼠的鑒定：根據發生移碼突變情況，選取的 Founder 7小鼠、Founder 13小鼠、和Founder 18小鼠分別與野生型C57小鼠交配，出生的小鼠兩周齡后按上述方法進行基因型鑒定。通過測序圖可分析F1代小鼠的突變情況：如果測序峰全是單峰說明該小鼠是WT（野生型）；如果測序圖出現雙峰則該小鼠為雜合子；如果測序圖也是單峰但是在預期位置出現缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠，這在圖3中已經進行了類似分析。我們從中選出4種突變類型#7-T1-1（T1缺失2個堿基CT）、#7-T1-2（T1缺失4個堿基GCTC）、#13-T1-1（T1缺失2個堿基TG）、#18-T1-1（T1缺失2個堿基TC）建立穩定遺傳F1小鼠品系。四品系F1小鼠的突變位點及突變后導致提前產生終止密碼子的位置見表1。基因型中黑體標記部分是TALEN設計敲除的靶位點序列，下劃線部分為敲除的基因序列，這些缺失突變都會導致提前產生終止密碼子。

2.2 Fndc5敲除小鼠的初步分析

2.2.1 Fndc5小鼠體重分析：通過成功建立和鑒定四品系F1小鼠后，將每個品系之間進行雜交配對，對出生的小鼠進行基因分型鑒定，分別在1月齡、2月齡進行所有出生小鼠的體重測量，體重分析時將雌雄分開，進行純合子與WT之間的體重差異分析，結果見圖4。結果表明小鼠生長正常，在1月齡、2月齡純合子和WT小鼠之間體重沒有統計學差異。

2.2.2 Fndc5在小鼠不同組織的表達情況分析：檢測Fndc5在不同組織內的表達情況有助于下一步的體內功能研究。提取小鼠不同組織H（心臟）、K（腎臟）、B（大腦）、L（肝臟）、TA（肌肉）進行液氮研磨提取mRNA，反轉錄成cDNA進行熒光定量PCR，選取18s作為內參，結果發現Fndc5在H、B、TA中表達量較高，在K、L中表達很少，如圖5。

圖2 Fndc5 TALEN的SSA活性檢測Fig.2 Detection of the Fndc5 TALEN SSA activity

注：突變型1的DNA序列（下指箭頭所指峰形）和突變型2的DNA序列（上指箭頭所指峰形）。圖3 Fndc5基因敲除首建鼠的鑒定Note.The DNA sequence of mutant 1 peak shape（black arrows）and the DNA sequence of mutant 2 peak shape（red arrows）.Fig.3 Identification of Fndc5 first built knockout mice

表1 四品系F1小鼠的突變情況Tab.1 The mutation of four different Fndc5-KO lines of mice

注：A為1月齡體重分析結果，B為2月齡體重分析結果。圖4 Fndc5小鼠不同年齡體重分析Note.A：The Results of body weight analysis at one month of age.B：The?Results of body weight analysis at two months of age.Fig.4 Analysis of body weight of the Fndc5 mice at different ages.

注：H-心臟，K-腎臟，B-大腦，L-肝臟，TA-肌肉圖5 Fndc5在小鼠不同組織的表達情況分析。Note.H-heat.K-kidney.B-brain.L-liver.TA-muscleFig.5 Fndc5 expression in different tissues in the mice.

3 討論

Fndc5作為Irisin（myokine）的前體，作用于白色脂肪提高了全身的產熱能力，促進了白色脂肪向棕色脂肪的轉化，這一研究從發現伊始就被認為可作為治療糖尿病的靶點。但是經過幾年的研究，爭議一直沒有平息：Fndc5裂解產生irisin的機制是什么？Irisin在不同組織細胞發揮作用的受體？Irisin在人體內是否發揮積極作用？總而言之關于它在小鼠及人體內的研究還急需廣泛開展。

目前關于它在腦、骨髓中的功能研究已經取得了一些進展，但是關于它在肌肉中的研究還未見報道，我們已經成功構建了4種品系Fndc5敲除小鼠，各自的突變類型在上文中也進行了分析，并建立了穩定遺傳F1小鼠。我們發現每個品系出生小鼠符合正常的孟德爾比率，生長沒有受到影響，在不同年齡段體重沒有出現明顯差異，我們也分析了Fndc5在不同組織內的表達分析，發現其在H、B、TA中表達量較高，這為我們下一步開展其在肌肉中的功能研究提供了基礎。有趣的是，通過Fndc5抗體進行檢測敲除小鼠時發現WT和純合子都出現條帶，我們認為本實驗中利用TALEN技術構建敲除小鼠模型只是在Fndc5的FNIII domain缺失了幾個堿基，導致終止密碼子提前產生，從而是蛋白質的功能缺失。但是經過缺失突變的Fndc5還是會產生70-110aa長的蛋白質，關于這部分蛋白質是否能發揮一定的功能還不知道，所以后續可能還需要其他的手段去確切的證實Fndc5敲除小鼠是否成功。

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〔修回日期〕2016-02-25

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）06-0037-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.008

［基金項目］國家自然科學基金面上項目（81471070）；“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09101、2012ZX09301002-001）；諾華諾德-協和英才基金（肌信息素抵抗肥胖作用機理的研究）；藥植所創新團隊發展計劃資助。

［作者簡介］吳子環（1990-），男，碩士研究生，專業：生物功能基因研究，E-mail：wuzihuan1122@163.com。

［通訊作者］金文（1971-），女，副研究員，博士，研究方向：代謝性疾病藥物藥效學研究，E-mail：wjin@implad.ac.cn。showed no significant differences.Finally high Fndc5 expressions in the muscles，heart and other organs were determined. Conclusions We Have for the first time successfully generated Fndc5 knockout（KO）mouse model using TALEN mediated DNA targeting technique，and performed preliminary analysis.This Fndc5 knockout（KO）mouse model provides a novel tool for further studies on the in vivo function of FNDC5.

Constructtion of a Fndc5 knockout mouse model by TALEN-mediated DNA targeting

WU Zi-huan1，2，HU Xiong-bing3，MAO Feng-yi2，WANG Chao4，ZHANG Bin2，ZHUANG Feng-feng3，HU Ke-ping2，SUN Xiao-bo2，LIU Xiao1，KUANG Shi-huan2，4，JIN Wen2
（1.School of Ocean Biology，Ningbo University，Ningbo 315000，China；2.Beijing Key Laboratory of Innovative Drug Development of Traditional Chinese Medicine（Natural Medicine）and Translational Medicine，CAMS-Purdue Associate Laboratory of Adipose Metabolism，Center of Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193；3.Beijing Viewsolid Biotech Company Ltd.，Beijing 100085；4.Department of Animal Science，Purdue University，USA）

【Abstract】Objective To construct Fndc5 knockout mouse models and provide animal models for related studies in the future.Methods Indels were introduced into FNIII domain of Fndc5 gene by TALEN technology in mice，and genotypes were identified by sequencing.To set stable genetic system by pairing.Then at mRNA and DNA levels identified the genetype of born mice.At the same time the body weight and blood glucose of the mice at different ages were analyzed. Finally the Fndc5 expression in the kidney，liver，brain，muscles，heart and other organs was determined by qPCR. Results Four different Fndc5-KO lines were generated.The body weight and blood glucose of the mice at different ages

【Key words】Skeletal muscle；Fndc5；Fibronectin；TALEN；Knockout mouse model