補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達及血-腦脊液屏障通透性的影響研究

劉紹晨，吳曉光，楊 嵐，李義學，仇志富

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·論著·

·中醫·中西醫結合研究·

補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達及血-腦脊液屏障通透性的影響研究

劉紹晨，吳曉光，楊 嵐，李義學，仇志富

目的探討補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4(AQP4)表達及血-腦脊液屏障通透性的影響。方法2014年3月—2015年11月，采用隨機數字表法將成年雄性SPF級SD大鼠分為假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組，各24只。其中模型組、補陽還五湯各劑量組制備腦出血模型。造模后第2天起，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組灌胃補陽還五湯，藥量分別為13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，連續給藥14 d，假手術組及模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。免疫組織化學法檢測磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)表達水平，免疫熒光標記法檢測AQP4表達水平，干濕重法檢測腦組織含水量，甲酰胺法檢測血-腦脊液屏障通透性〔以依文思藍(EB)含量表示〕。結果假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組PI3K、AKT表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組PI3K表達水平高于模型組；補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AKT表達水平高于模型組(P<0.05)。5組AQP4表達水平比較，差異有統計學意義(F=95.79，P<0.001)；其中補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AQP4表達水平高于模型組(P<0.05)。5組腦組織含水量比較，差異有統計學意義(F=16.21，P<0.001)；其中補陽還五湯高劑量組腦組織含水量低于模型組(P<0.05)。5組腦組織EB含量比較，差異有統計學意義(F=60.05，P<0.001)；其中補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組腦組織EB含量低于模型組(P<0.05)。結論補陽還五湯能夠減輕腦出血誘發的腦水腫，其機制可能與其激活PI3K/AKT信號轉導通路，調控AQP4極性表達，降低血-腦脊液屏障通透性有關。

腦出血；補陽還五湯；腦水腫；水通道蛋白質4；血腦屏障

劉紹晨，吳曉光，楊嵐，等.補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達及血-腦脊液屏障通透性的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(21)：2557-2561.[www.chinagp.net]

LIU S C，WU X G，YANG L，et al.Effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4 expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats[J].Chinese General Practice，2016，19(21)：2557-2561.

腦出血占所有腦卒中的10%～15%，具有高發病率、高致殘率及高病死率，是最嚴重的一種腦卒中類型，目前尚無較好的方法提高腦出血患者的生存率或改善其生活質量[1]。研究表明，腦出血后繼發性損傷在患者神經功能惡化過程中發揮重要作用，而腦出血后腦水腫則是繼發性損傷中的重要環節之一[2]。水通道蛋白4(AQP4)是水通道蛋白家族(AQPs)在腦組織中含量最豐富、分布最廣泛、功能最重要的跨膜轉運蛋白，參與介導水分子的跨膜轉運，當腦出血時腦組織中存在AQP4極性表達的缺失，促進出血性腦水腫的發生[3]。補陽還五湯是一種臨床上治療缺血性腦卒中的常用方藥，具有增強微血管抗損傷能力，減輕腦缺血誘發的腦組織水腫等作用[4]，但是其抑制腦水腫作用的具體機制仍不明確。研究發現，腦組織中磷酸化肌醇磷脂3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號轉導通路激活后能夠介導或者調控與凋亡、水腫密切相關的蛋白或基因等發生相應變化來實現腦保護作用，而其發揮顯著效應的前提是藥物能夠降低血-腦脊液屏障通透性[3]。本研究采用Rosenberg法建立大鼠腦出血模型，檢測PI3K、AKT、AQP4表達水平的變化，探討補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織水腫及血-腦脊液屏障通透性的影響及其作用機制。

本研究背景：

腦出血屬于中醫學“卒中”“薄厥”“中風”范疇，具有高發病率、高病死率、高致殘率、高復發率的特點，是腦卒中中最為嚴重的一種。腦出血后繼發腦水腫是患者神經功能惡化的重要影響因素。從機制上講，出血性疾病要慎用活血祛癖之藥，而腦出血雖為出血性疾病，但《血證論》云:“既是離經之血，雖清血、鮮血亦是癖血”“總以祛癖為要”。現代藥理學研究表明，某些活血化癖藥具有加速和促進血腫溶化和吸收，以解除腦受壓的作用。補陽還五湯是益氣活血的代表方，希望能為“活血化瘀藥”應用腦出血治療，加速和促進血腫溶化和吸收，解除腦受壓的程度提供新思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物成年雄性SPF級SD大鼠120只，體質量230～250 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。大鼠采用隨機數字表法分成假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組，每組24只。大鼠在室溫26～28 ℃環境下飼養，自由進食進水，自然光照。

1.2實驗藥品及試劑補陽還五湯由生黃芪120.0 g、當歸尾6.0 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龍3.0 g、桃仁3.0 g、紅花3.0 g組成，購自承德大藥房，通過水煎醇沉法制備成濃度為5.3 g/ml的水煎醇沉物。兔抗大鼠PI3K、AKT多克隆抗體購自武漢博士德生物科技有限公司；兔抗大鼠AQP4單克隆抗體購自Abcam公司；其他試劑為國產分析純。1.3動物模型制備及給藥2014年3月—2015年11月在承德醫學院基礎醫學研究所完成本實驗，參照LIEW等[2]方法制備大鼠腦出血模型，SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，取俯臥位固定于鼠腦立體定位儀上，局部消毒后，切開大鼠皮膚，使其暴露顱骨，進行鉆孔，在大鼠的前囪后方約1.4 mm，右旁開約3.2 mm處垂直進針，進針深度約為5.6 mm，可在近內囊的蒼白球內進行定位，定位之后用微量進樣器緩慢注入0.5 μl膠原酶滅菌的0.9%氯化鈉溶液2.5 μl，注射時間約2 min，留針約5 min，退針約0.5 mm，再留針約5 min，慢慢拔出針頭，骨蠟封閉骨窗，皮膚縫合。造模成功的評價方法：對手術后清醒的造模SD大鼠，按照Zeal Longa 5級評分法判斷腦出血模型制備是否成功。0分：無神經系統功能缺失癥狀出現，一切活動均正常；1分：SD大鼠在接受提尾懸空動作時，腦出血對側前肢不自主的出現屈曲、抬高等動作，并且伴隨著肩內收、肘關節伸直等表現，此時為輕度局灶性神經功能缺陷癥狀；2分：SD大鼠在具有輕度局灶性神經功能缺陷癥狀表現的同時，又伴隨行走時向腦出血對側轉圈現象，稱為中度局灶性神經功能缺陷癥狀；3分：SD大鼠在行走時其身體會向腦出血對側傾倒，稱為重度局灶性神經功能缺陷癥狀；4分：行走極度困難，甚至無意識。1～3分為腦出血模型造模成功大鼠。假手術組只在相應位置鉆孔，插入注射器，留針10 min，不注射任何物質。造模后第2天起，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組灌胃補陽還五湯，藥量分別為13.2、26.5、53.0 g·kg-1·d-1，連續給藥14 d，假手術組及模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4PI3K、AKT表達水平檢測采用隨機數字表法每組選取6只大鼠注射3.5 mg/kg水合氯醛溶液麻醉，4%多聚甲醛溶液左心室插管灌注固定，取視交叉至大腦裂之間腦組織，常規石蠟包埋。Leica切片機連續5 μm冠狀切片。常規脫蠟、梯度乙醇浸水，枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，山羊血清封閉，腦切片上分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多克隆抗體，4 ℃靜置12 h，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。利用磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統計算400倍鏡下血腫灶周圍3個視野的陽性細胞數，取平均值。

1.5AQP4表達水平檢測采用隨機數字表法每組選取6只大鼠斷頭取血腫周圍腦組織，0.01 mol/L PBS洗凈血液，加入裂解液和10 μl苯甲基硫酰氟(PMSF)(10 g/L)，4 ℃勻漿，以10 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液，BCA法蛋白定量。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜、封閉后，滴加AQP4一抗(1∶200)，4 ℃冰箱過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶1 000)37 ℃溫箱孵育1 h，熒光發光液發光，X線膠片曝光顯影后，利用Quantity One軟件對X線膠片上AQP4表達的灰度值進行分析。

1.6腦組織含水量檢測采用隨機數字表法每組選取6只大鼠斷頭、取出血側腦組織于分析天平稱濕重，再置于100 ℃真空干燥箱烘干24 h，再稱干重。腦組織含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.7血-腦脊液屏障通透性檢測每組剩余6只大鼠乙醚麻醉，由尾靜脈注入4 ml/kg 2%伊文思藍(EB)溶液。參照文獻[5]的方法計算腦組織EB含量。EB含量升高，表明血-腦脊液屏障通透性增強。

2　結果

2.1各組PI3K、AKT表達水平比較PI3K和AKT陽性表達呈棕褐色顆粒樣物質，均位于細胞的胞質(見圖1、2，本文圖1、2彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組PI3K、AKT表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組PI3K表達水平高于假手術組，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組PI3K表達水平高于模型組，補陽還五湯高劑量組PI3K表達水平高于補陽還五湯低劑量組和補陽還五湯中劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AKT表達水平高于假手術組，補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AKT表達水平均分別高于模型組和補陽還五湯低劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2各組AQP4表達水平比較假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AQP4表達水平分別為(0.12±0.01)%、(0.22±0.01)%、(0.27±0.02)%、(0.27±0.02)%、(0.28±0.02)%。5組AQP4表達水平比較，差異有統計學意義(F=95.79，P<0.001)；其中模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AQP4表達水平高于假手術組，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組AQP4表達水平高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

Table 1Comparison of the expression of PI3K and AKT among five groups

組別只數PI3KAKT假手術組65.8±0.95.5±1.1模型組68.8±1.4a8.3±1.9補陽還五湯低劑量組611.2±1.4ab9.9±2.4a補陽還五湯中劑量組612.6±1.8ab13.2±2.6abc補陽還五湯高劑量組15.8±2.1abcd15.8±2.7abcF值31.3021.10P值<0.001<0.001

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與補陽還五湯低劑量組比較，cP<0.05；與補陽還五湯中劑量組比較，dP<0.05；PI3K=磷酸化肌醇磷脂3激酶，AKT=蛋白激酶B

圖1　各組PI3K表達的免疫組織化學結果(SABC法，×400)

圖2　各組AKT表達的免疫組織化學結果(SABC法，×400)

2.3各組腦組織含水量比較假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組大鼠腦組織含水量分別為(60.0±2.6)%、(78.9±5.4)%、(73.7±4.5)%、(72.7±4.5)%、(69.9±3.7)%。5組腦組織含水量比較，差異有統計學意義(F=16.21，P<0.001)；其中模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組腦組織含水量高于假手術組，補陽還五湯高劑量組腦組織含水量低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織EB含量比較假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組大鼠腦組織EB含量分別為(1.4±1.0)、(17.0±3.1)、(14.2±1.9)、(12.2±1.6)、(11.7±1.2) μg/g。5組腦組織EB含量比較，差異有統計學意義(F=60.05，P<0.001)；其中模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組腦組織EB含量高于假手術組，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組腦組織EB含量低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

PI3K/AKT是一種促細胞存活的信號轉導通路，參與腦缺血的病理過程，與神經元的存活密切相關[6]。腦出血后，機體可以釋放出一些能夠將具有酪氨酸激酶活性的受體激活的物質，如神經細胞生長因子、整合素等，受體磷酸化后會特異性結合PI3K的調節亞基，從而將PI3K激活；同時兼備脂類激酶活性與蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使細胞膜上的肌醇發生磷酸化，生成第二信使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[7]。PI3K與其下游效應分子AKT的PH結構域結合，使AKT由抑制狀態變為激活狀態，進而通過直接將其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者間接改變編碼凋亡相關蛋白的基因表達水平來實現腦保護作用[6，8]。總之，PI3K/AKT信號轉導通路激活后，能夠作用于Bcl-2、BAX、Caspase-3、核因子(NF)-κB等下游凋亡靶蛋白，通過激活或抑制其表達來發揮生物學效應。本研究結果顯示，不同劑量補陽還五湯組PI3K、AKT表達水平高于模型組，與蔡俊等[9]在補陽還五湯對腦缺血大鼠的影響研究中所得結果一致，提示腦出血中補陽還五湯發揮抑制腦水腫的腦保護效果與PI3K/AKT信號轉導通路的激活密不可分。

AQP4在星形膠質細胞足突形成的膠質界膜和血管周圍星形膠質細胞表面以及滲透壓感受區有豐富的特異性表達，是膠質細胞與血管之間水的調節和轉運的結構基礎[3]，在維持大腦水平衡中發揮至關重要的作用。也就是說，AQP4只有極性表達在星形膠質細胞終足膜上時，才能夠正確發揮其調控水轉運的功能[10]。腦出血時腦組織中存在AQP4極性表達缺失，促進出血性腦水腫的發生[3]。而AQP4的水通透性可以被多種蛋白可逆磷酸化調控[11]。以往研究發現，PI3K/AKT信號轉導通路可以調節AQP3的表達，而AQP3與AQP4同屬于AQPs亞族，兩者結構有許多相似之處，且兩者均在腦組織內高度表達[12-13]，由此推測，PI3K/AKT信號轉導通路可以通過調節AQP4的表達而在腦出血所致的腦水腫中發揮作用。本研究發現，補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯中劑量組、補陽還五湯高劑量組大鼠AQP4表達水平明顯增強，腦組織含水量降低，血-腦脊液屏障通透性降低，提示補陽還五湯通過對PI3K/AKT信號轉導通路的激活實現了對AQP4表達的調控，從而實現減輕腦水腫，降低血-腦脊液屏障通透性，保護腦組織的作用。

因此，補陽還五湯對腦出血具有較好的治療作用，其機制可能與其激活PI3K/AKT信號轉導通路，并通過該通路調控腦組織密切相關蛋白AQP4，使其發生極性表達，進而降低血-腦脊液屏障通透性，從而實現減輕腦組織水腫，保護神經功能的作用。

作者貢獻：劉紹晨、吳曉光、李義學進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；劉紹晨、楊嵐、李義學、仇志富進行實驗實施、評估、資料收集；吳曉光進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Effects of Buyanghuanwu Decoction on Aquaporin 4 Expression and the Permeability of the Blood Brain Barrier in Cerebral Hemorrhage Rats

LIUShao-chen，WUXiao-guang，YANGLan，etal.

DepartmentofPathology，ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China

ObjectiveTo explore the effects of Buyanghuanwu decoction on aquaporin 4(AQP4)expression and the permeability of the blood brain barrier in cerebral hemorrhage rats.MethodsFrom March 2014 to November 2015，SPF level adult male SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups，24 in each group.Model group and Buyanghuanwu decoction groups prepared models of cerebral hemorrhage.Since two days after modeling，Buyanghuanwu decoction low，medium，and high dose groups were given Buyanghuanwu decoction by gastric perfusion，the dose was 13.2 g·kg-1·d-1，26.5 g·kg-1·d-1and 53.0 g·kg-1·d-1respectively，continuously for 14 days，and sham operation group and model group were given the equal volume of the corresponding 0.9% sodium chloride solution.The expression of phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)and protein kinase B(AKT)was detected by immunohistochemistry.The expression of AQP4 was detected by immunofluorescence labeling method.Content of water in brain was detected by wet and dry weight method，and formamide method was used to detect the blood-brain barrier permeability.ResultsSham operation group，model group，Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were significantly different in the expression of PI3K and AKT(P<0.05)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of PI3K；Buyanghuanwu decoction medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AKT(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the expression of AQP4(F=95.79，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were higher than model group in the expression of AQP4(P<0.05).The 5 groups were significantly different in brain water content(F=16.21，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction high dose group was lower than model group in brain water content(P<0.05).The 5 groups were significantly different in the EB content of cerebral tissue(F=60.05，P<0.001)；Buyanghuanwu decoction low，medium and high dose groups were lower than model group in EB content of cerebral tissue(P<0.05).ConclusionBuyanghuanwu decoction can alleviate encephaledema induced by cerebral hemorrhage，and its mechanism may be related with the activation of PI3K/AKT singal，the regulation of the extreme expression of AQP4，and the reduction of blood-brain barrier permeability.

Cerebral hemorrhage；Buyanghuanwu decoction；Brain edema；Aquaporin 4；Blood-brain barrier

河北省高等學校重點學科病理學與病理生理學資助項目(2013)；河北省中醫藥抗癡呆重點研究室資助項目(2014)；承德醫學院校級重點資助項目(201607)

067000 河北省承德市，承德醫學院病理學教研室(劉紹晨)；承德醫學院基礎醫學研究所 河北省中醫藥抗癡呆重點研究室(吳曉光，楊嵐，仇志富)；承德醫學院附屬醫院(李義學)

吳曉光，067000 河北省承德市，承德醫學院基礎醫學研究所 河北省中醫藥抗癡呆重點研究室；E-mail：ewxg@qq.com

R 743.34 R 742

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.21.013

2016-01-20；

2016-05-19)