布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學特性研究

苗玉強，劉　軍，孫　洋，紀　雪，祝令偉，周　偉，郭學軍，劉　爽，陳　萍，馮書章

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布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學特性研究

苗玉強1,2，劉軍2，孫洋2，紀雪2，祝令偉2，周偉2，郭學軍2，劉爽2，陳萍1，馮書章2

1.吉林農業大學食品科學與工程學院，長春130118；2.解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春130122

摘要：目的利用小鼠模型對布魯氏菌菌殼、布魯氏菌S2活菌和福爾馬林滅活菌的安全性和免疫學特性進行比較研究。方法利用豬布魯氏菌S2株和重組裂解質粒制備出布魯氏菌菌殼，將布魯氏菌菌殼、布魯氏菌S2活菌和福爾馬林滅活菌通過腹腔注射免疫小鼠，進行安全性比較分析。監測免疫后小鼠的血清抗體水平、脾臟T淋巴細胞分型，并進行免疫攻毒實驗。結果與布魯氏菌弱毒疫苗菌株S2比較，布魯氏菌菌殼具有更好的安全性，免疫小鼠后能產生與弱毒菌株相似的血清抗體水平、脾CD3+和CD4+ T淋巴細胞反應，并具有與之相當的免疫保護作用。結論布魯氏菌菌殼具有良好的安全性，能刺激機體產生體液免疫和細胞免疫反應，可作為預防布魯氏菌病的新型候選疫苗。

關鍵詞：布魯氏菌；菌殼；安全性；免疫原性

Funded by the Scientific and Technological Development Projects of Jilin Province (No. 20100231) and the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (No. 201303042)

布魯氏菌(Brucella)是一種危害嚴重的人獸共患胞內寄生病原菌。布魯氏菌可引起人、家畜、野生動物、甚至海洋哺乳動物的布魯氏菌病[1]，主要癥狀為發熱、流產、不育、慢性關節炎及神經損傷等。布魯氏菌病流行范圍廣、傳染性強，嚴重危害人類健康和畜牧業發展，導致世界范圍內的嚴重經濟損失和公共衛生問題[2]。我國從1995年起，人布魯氏菌病病例逐年增加[3]，2010年有35 000人布魯氏菌病病例[4]。據統計，大約有85%人布病是由于接觸了布魯氏菌感染的羊所引起[5]。

目前臨床上預防布魯氏菌病的疫苗均是弱毒活疫苗，具有一定的毒副作用，全球許多實驗室正在致力于開發布魯氏菌病新型疫苗[6]。菌殼(Bacterial ghosts)是近年來頗受關注的一種新型細菌滅活方法。菌殼一般通過噬菌體PhiX174的裂解酶E基因在細菌內表達制備而成。菌殼保留了原始細菌的脂多糖、脂質A和肽聚糖等天然的外膜結構和表面抗原，具有很好的免疫原性，因此，菌殼是一種具有良好應用前景的滅活疫苗[7]。本實驗室利用廣宿主穿梭質粒和裂解基因E成功制備了豬布魯氏菌S2菌殼[8]和粗糙型羊布魯氏菌菌殼[9]，在此基礎上，本研究利用小鼠模型進一步對豬布魯氏菌S2菌殼的安全性和免疫學特性進行研究，評價其安全性、免疫原性和對小鼠模型的免疫保護作用，為將來研制布魯氏菌菌殼疫苗提供數據。

1材料和方法

1.1菌株豬布魯氏菌S2株、重組布魯氏菌S2(pBBR1MCS-E)均由本實驗室保存或構建[8]。

1.2實驗動物6-8周齡雌性BALB/c小鼠(清潔級)，體重約18～20 g/只，購自長春市生物制品研究所。

1.3主要試劑辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG由Sigma-Aldrich公司生產；羊抗鼠CD3e PerCP-Cy5.5、CD4 FITC和CD8a PE為eBioscience公司產品；TSB培養基購自青島海博生物技術有限公司。

1.4布魯氏菌S2菌液、布魯氏菌菌殼和布魯氏菌甲醛滅活液的制備

1.4.1布魯氏菌S2菌液的制備將1mL新鮮培養的布魯氏菌S2接種到100 mL TSB液體培養基，37 ℃振蕩培養24 h。然后于4℃，6 000r/min離心10 min。沉淀用生理鹽水洗滌沉淀2次，用原始菌液等量的生理鹽水重懸待用。

1.4.2布魯氏菌S2菌殼(BrucellasuisS2 ghosts，BSG)的制備將1 mL新鮮培養的布魯氏菌S2(pBBR1MCS-E)接種到100 mL TSB液體培養基(Kan 100 μg/mL)，28℃振蕩培養24h，轉移至42 ℃繼續振蕩培養48 h。然后于4 ℃，60 00 r/min離心10 min。沉淀用5% NaCl溶液凍融2次，用生理鹽水洗滌2次，然后用原始菌液等量的生理鹽水重懸，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.4.3布魯氏菌S2甲醛滅活液(formalin-killedBrucella，FKB)的制備將1 mL新鮮培養的布魯氏菌S2接種到100 mL TSB液體培養基，37 ℃振蕩培養24 h后，加入甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃繼續振蕩培養48 h。然后于4 ℃，60 00 r/min離心10 min。沉淀用生理鹽水洗滌2次，用原始菌液等量的生理鹽水重懸，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.4.4布魯氏菌菌殼和甲醛滅活液中的細胞計數按文獻[10]進行，具體方法：將制備的布魯氏菌菌殼和布魯氏菌甲醛滅活液進行10倍梯度稀釋后，取清潔的Neubauer計數板，在計數區上蓋上一塊蓋玻片，將稀釋后的液體加入計數室，用光學顯微鏡進行計數，計算每毫升液體中的細胞數。

1.5布魯氏菌S2菌殼的安全性實驗將BABL/c小鼠，隨機分為7組，每組10只。其中6組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2菌液、布魯氏菌S2菌殼(BSG)和布魯氏菌S2甲醛滅活液(FKB)，每個樣品注射2組。第7組小鼠腹腔注射生理鹽水作為陰性對照，注射總體積均為200 μL/只小鼠。分組和注射劑量見表1所示。觀察小鼠臨床癥狀，記錄小鼠體重變化。注射2周以后，將小鼠斷頸處死，摘取小鼠的脾臟，稱重。

1.6布魯氏菌S2菌殼的免疫原性實驗

1.6.1免疫小鼠6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為4組，每組10只。其中3組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2、BSG和FKB，第4組小鼠腹腔注射生理鹽水作為陰性對照。S2菌注射免疫劑量為106CFU/只小鼠，BSG和FKB注射免疫劑量相當于原活菌量為107CFU/只小鼠。每組小鼠均注射免疫2次，注射間隔為4周。

1.6.2小鼠血清抗體水平的檢測每組免疫小鼠取5只，初次免疫后，每隔1周對小鼠斷尾采血，分離血清，以生理鹽水注射組小鼠血清為陰性對照，用ELISA方法測定血清中IgG抗體效價。將布魯氏菌S2培養液離心后用包被液洗滌、重懸、稀釋后，加入到ELISA板包被，二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，檢測血清IgG抗體效價。

1.6.3小鼠脾臟T淋巴細胞亞型分析每組免疫小鼠取5只，末次免疫后第14 d，將小鼠斷頸處死，無菌摘取小鼠脾臟進行T淋巴細胞亞型分析。用200目的尼龍網篩分離脾淋巴細胞，Tris-NH4C1室溫作用5 min破碎紅細胞，用預冷的PBS重懸細胞。用臺盼藍染色計算活細胞數，并調整細胞濃度為2×106cells/mL。試驗組和對照組小鼠脾淋巴細胞各取100 μL細胞懸液，分別加入3種標記抗體(羊抗鼠CD3e PE-Cy5、CD4 FITC和CD8a PE)各5 μL，室溫孵育20 min。用預冷的PBS洗滌后，加入0.5 mL PBS重懸細胞，用流式細胞儀(FCM)進行檢測。每個樣品檢測10 000個細胞，分析T淋巴細胞亞型比例。

1.7布魯氏菌S2菌殼的免疫攻毒實驗6-8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組5只。3組小鼠分別腹腔注射布魯氏菌S2(陽性對照)、BSG和PBS(陰性對照)。S2菌注射免疫劑量為106CFU/只小鼠，BSG注射免疫劑量相當于原活菌量為107CFU/只小鼠。每組小鼠均注射免疫2次，注射間隔為4周。注射免疫2周后，用馬爾他布魯氏菌16M(B.melitensis16M)腹瀉注射攻毒，攻毒劑量為105CFU/只小鼠。攻毒2周后，將所有小鼠斷頸處死，無菌摘取脾臟，按文獻[11]方法統計比較不同組小鼠脾臟載菌量。

2結果

2.1布魯氏菌S2菌殼對小鼠的安全性實驗注射布魯氏菌S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)后，小鼠的臨床癥狀見表1所示，各組小鼠體重變化曲線見圖1所示。結果表明，注射S2組小鼠出現體重急劇下降、精神沉郁、聳毛、顫抖、死亡等臨床表現，其中108CFU劑量組小鼠全部死亡。而

注射BSG和FKB組小鼠與陰性對照組小鼠相似，均未出現明顯臨床癥狀，體重變化曲線一致。說明布魯氏菌S2菌殼對小鼠具有良好的安全性。

圖1注射布魯氏菌小鼠S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)小鼠平均體重變化曲線

Fig.1Mean weights of mice following injection ofB.suisS2,B.suisghosts (BSG) and formalin-killedB.suis(KFB)

實驗小鼠平均脾臟重量見表1所示，S2組小鼠脾臟表現極度腫大，平均脾臟重量約為0.406 g，與其它組差異顯著；FKB組和BSG小鼠脾臟無腫大現象，平均脾臟重量與陰性對照組相似，無顯著差異。

表1　不同劑量豬布魯氏菌S2、布魯氏菌菌殼(BSG)和福爾馬林滅活菌(FKB)對小鼠的致病性

a Dosages of BSG and FKB are presented as the number of corresponding dead bacteria.

b A: Depression; B: ruffled hair; C: trembling; D: death (all death happened in 4 days after injection.); None: no clinical symptoms.

2.2小鼠血清抗體水平檢測從S2、BSG和FKB免疫組小鼠血清中均能檢測到特異性抗體，BSG組小鼠免疫后第6～7周血清抗體效價達到最高(圖2)。BSG免疫組小鼠抗體效價略高于布魯氏菌S2免疫組小鼠，二者之間差異無統計學意義。BSG免疫組小鼠和S2免疫組小鼠的血清抗體效價顯著高于FKB組小鼠的血清抗體效價。結果表明布魯氏菌菌殼可刺激機體產生與活疫苗S2相似的體液免疫水平。

2.3小鼠T淋巴細胞亞群分析各組小鼠脾臟T淋巴細胞經處理后經流式細胞儀檢測，結果T淋巴細胞亞群比例見表2所示。與FKB免疫組小鼠和陰性對照組比較，BSG免疫組和S2免疫組小鼠脾臟T淋巴細胞中CD3+和CD4+細胞比例顯著升高，而BSG免疫組與S2免疫組的CD3+和CD4+細胞差異無統計學意義。

圖2　腹腔注射組小鼠血清抗體水平

Fig.2Induction of specific IgG antibodies by different vaccine preparation

表2　實驗小鼠脾臟T淋巴細胞亞群分析結果(%) ±s)

Note:*Compared with the control saline group,P<0.05.

2.4免疫攻毒實驗用布魯氏菌16M株攻毒后，各組小鼠的脾臟載菌量如表3所示。其中BSG組和S2免疫組小鼠的脾臟載菌量顯著低于PBS對照組。BSG組和S2組的保護單位(Units of protection)分別為1.54和1.74，兩組小鼠的脾臟載菌量無顯著差異，說明布魯氏菌菌殼具有與活疫苗S2相似的免疫保護效果。

表3小鼠免疫攻毒實驗結果

Tab.3Protection against B. melitensis 16M provided to BALB/c mice by vaccination with B. suis S2 ghosts

Treatmentgroup(n=5)Log10CFUofB.melitensis/spleenaUnitsofprotectionbBrucellaghosts(BSG)3.54±0.0251.54cBrucellavaccineS23.34±0.1711.74cPBScontrol5.08±0.121-

Note:aThe number of bacteria in spleens (CFU/spleen) is represented as the mean logCFU SD per group.

bUnits of protection were obtained by subtracting the mean log CFU/spleen of the vaccinated group from the mean log CFU/spleen of the control (PBS) group.

cSignificantly different compared to PBS controls group (P< 0.05).

3討論

免疫預防是防控布病疫情的最佳方法之一，當前臨床使用的疫苗均為弱毒活疫苗，普遍存在著一定毒副作用，尤其對于孕畜及幼齡動物更是如此。

豬布魯氏菌S2株是在我國廣泛使用的活疫苗菌株，2011年已完成了該菌株的全基因組測序[12]。由于布魯氏菌S2株屬于弱毒活疫苗，仍然具有一定的毒力，在臨床使用上還存在安全隱患。本實驗室利用重組穿梭裂解質粒成功制備出了布魯氏菌S2菌殼[8]。布魯氏菌菌殼屬于滅活疫苗，理論上其安全性應優于弱毒活疫苗，本研究對布魯氏菌菌殼與活疫苗S2安全性的比較研究也證實，布魯氏菌菌殼的安全性顯著高于活疫苗S2菌株，即使菌殼的接種劑量高于S2劑量的100倍以上，其對小鼠的影響仍然顯著小于S2。布魯氏菌菌殼的安全性與甲醛滅活菌的安全性相當。

國內外對于評價布魯氏菌病疫苗的常用方法為計算脾臟載菌量[13-14]，本研究也采用攻毒后計算小鼠脾臟載菌量的方法評價布魯氏菌菌殼的免疫保護效果，并檢測免疫小鼠的血清抗體水平和脾臟T淋巴細胞分型。小鼠血清抗體IgG檢測結果表明，布魯氏菌菌殼與S2活菌刺激小鼠產生的抗體水平相當，均顯著高于FKB免疫組和陰性對照組。說明腹腔注射后布魯氏菌菌殼可刺激機體產生與活疫苗S2水平相似的體液免疫反應。小鼠脾臟T淋巴細胞亞型分析表明，布魯氏菌菌殼與活疫苗S2都能有效激活小鼠的細胞免疫反應，而且這者之間的細胞免疫水平并無顯著差異。

用布魯氏菌16M株攻毒后，布魯氏菌菌殼免疫組和活疫苗S2免疫組小鼠的脾臟載菌量顯著低于對照組，兩組小鼠的脾臟載菌量無顯著差異，其免疫保護單位(Units of protection)分別為1.54和1.74，說明布魯氏菌菌殼具有與活疫苗S2相當的免疫保護作用。

綜合本研究結果，與布魯氏菌S2活疫苗菌株比較，布魯氏菌菌殼具有更好的安全性和與之相當的免疫保護效果，可以作為預防布魯氏菌病的新型候選疫苗，但布魯氏菌菌殼作為疫苗的有效性和特異性免疫機制還有待深入研究。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.008

通訊作者：馮書章，Email: shuzhangf@yahoo.com；

中圖分類號：R378.5

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0251-05

Corresponding author:Liu Jun, Email: liujunbio@yahoo.com

收稿日期：2015-04-15；修回日期:2016-01-28

Safety and immunogenicity of Brucella suis strain S2 ghosts

MIAO Yu-qiang1,LIU Jun2,SUN Yang2,JI Xue2,ZHU Ling-wei2,ZHOU Wei2,GUO Xue-jun2,LIU Shuang2,CHEN Ping1,FENG Shu-zhang2

(1.FoodScienceandEngineering,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofMilitaryVeterinaryScience,theAcademyofMilitaryMedicalScienceofPLA,Changchun130122,China)

Abstract:With the purpose of investigating the safety and immunogenicity of Brucella suis strain S2 bacterial ghosts as a vaccine candidate, the recombinant strain S2(pBBR1MCS-E) was used for production of B. suis ghosts (BSG). The safety and immunogenicity of BSG were evaluated by using a murine model. The results suggested that BSG was as safe as formalin-killed B. suis. Compared with the B. suis strain S2, BSG demonstrated similar capacity of inducing pathogen-specific serum IgG antibody response, spleen CD3+ and CD4+ T cell responses, as the attenuated B. suis live vaccine. The results of mice immunization and infection showed that BSG could significantly reduce the number of bacteria in the spleens. These data suggest that Brucella ghosts could confer protection against Brucella infection and may be developed as a new vaccine candidate against Brucella infection.

Keywords:Brucella; bacterial ghosts; safety; immunogenicity

吉林省科技發展計劃資助項目(20100231)；公益性行業(農業)科研專項(201303042)

劉軍，Email: liujunbio@yahoo.com