三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距與圖像復(fù)原的關(guān)系

梁日柳，陳　華，莫春球，聶　雄

(廣西大學(xué)計(jì)算機(jī)與電子信息學(xué)院， 廣西南寧530004)

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三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距與圖像復(fù)原的關(guān)系

梁日柳，陳華，莫春球，聶雄

(廣西大學(xué)計(jì)算機(jī)與電子信息學(xué)院， 廣西南寧530004)

摘要：為研究三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距與圖像復(fù)原的關(guān)系，對(duì)數(shù)字共焦光學(xué)顯微成像系統(tǒng)3D-PSF的構(gòu)成、3D-PSF不同層距與圖像復(fù)原效果的關(guān)系進(jìn)行理論分析。通過(guò)仿真實(shí)驗(yàn)，研究了不同放大倍數(shù)的3D-PSF，在不同層距，相同層數(shù)和徑向大小的情況下與圖像復(fù)原效果的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明：層距小于0.6 μm時(shí)，放大倍數(shù)為40倍，圖像在層距為0.5 μm處取得最佳復(fù)原效果，放大倍數(shù)為20倍和10倍時(shí)，圖像在層距為0.025 μm處取得較好的復(fù)原效果。研究結(jié)果為在細(xì)胞切片的采集和三維顯微圖像復(fù)原實(shí)際應(yīng)用中對(duì)3D-PSF的層距選取提供了理論依據(jù)和選取方法。

關(guān)鍵詞：三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)；圖像復(fù)原；層距；采樣；改善信噪比

0引言

由于可以在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡基礎(chǔ)上，利用數(shù)學(xué)算法去除圖像中的離焦模糊成分，提高圖像分辨率，數(shù)字共焦顯微技術(shù)近年來(lái)迅速成為研究熱點(diǎn),以該技術(shù)發(fā)展的數(shù)字共焦顯微儀在遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物植物學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。在該技術(shù)中，沿著z軸方向(即光軸或者軸向)移動(dòng)生物細(xì)胞樣本通過(guò)生物光學(xué)顯微鏡物鏡焦平面，獲取序列二維切片圖像，然后使用三維顯微圖像復(fù)原算法進(jìn)行處理[2]，獲取清晰的二維圖像序列和三維圖像[3-6]。

在三維顯微圖像處理中，三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(three dimensional point spread function, 3D-PSF)的選取與圖像復(fù)原效果密切相關(guān)。研究表明，3D-PSF層數(shù)越多，復(fù)原效果越好，但同時(shí)處理的時(shí)間也越長(zhǎng)。當(dāng)3D-PSF層數(shù)一定時(shí)，3D-PSF層距的選取與圖像復(fù)原效果存在何種關(guān)系，一直是有待研究解決的問(wèn)題。

本文在三種不同的放大倍數(shù)下，通過(guò)仿真實(shí)驗(yàn)，使用四種不同層數(shù)的細(xì)胞樣本切片，研究不同層距，相同層數(shù)和徑向大小的3D-PSF與圖像復(fù)原的關(guān)系，為更好地獲取高分辨率圖像提供理論依據(jù)。

1光學(xué)顯微成像系統(tǒng)3D-PSF

1.1三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)結(jié)構(gòu)

圓形孔徑小散焦光學(xué)傳遞函數(shù)OTF的數(shù)學(xué)公式[7-9]如下：

(1)

其中w為散焦誤差，q為頻率，fc為系統(tǒng)截止頻率。計(jì)算不同散焦量的光學(xué)傳遞函數(shù)，可以獲得相應(yīng)散焦量的2D-PSF，進(jìn)而構(gòu)成雙錐體型3D-PSF[10]。

3D-PSF的空間大小包括軸向大小z和徑向大小(x-y)，其在離散空域里可視為一個(gè)三維矩陣。沿著3D-PSF雙錐體中心軸(z軸)不同的橫截面(x-y面)，對(duì)應(yīng)著一系列不同散焦量的徑向二維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(two dimensional point spread function, 2D-PSF)，其中z=0處的中間截面為焦面2D-PSF。

研究表明，3D-PSF的能量分布與放大倍數(shù)密切相關(guān)。三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的能量主要集中在雙錐體中部的錐頂附近區(qū)域，放大倍數(shù)越大，在z軸方向，能量擴(kuò)散程度越小，遠(yuǎn)離焦面z=0時(shí)能量迅速衰減，在徑向(即x-y面)方向上，能量擴(kuò)散程度越大，衰減速度緩慢，隨著放大倍數(shù)減小，三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的能量在z軸方向擴(kuò)散程度增大，衰減速度變緩，在徑向方向上，三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的能量擴(kuò)散程度小，主要分布在z軸周?chē)h(yuǎn)離z軸時(shí)能量迅速衰減。

1.2不同層距3D-PSF與圖像復(fù)原關(guān)系分析

圖像復(fù)原處理采用的3D-PSF空間大小決定著復(fù)原效果和復(fù)原時(shí)間，3D-PSF空間大小選取越大，復(fù)原效果越好，同時(shí)處理的時(shí)間也越長(zhǎng)。研究表明，3D-PSF的能量主要集中雙錐體中部區(qū)域，因此在進(jìn)行圖像復(fù)原時(shí)，通常舍去3D-PSF周?chē)蟛糠帜芰肯∩俚目臻g區(qū)域，而選取3D-PSF能量較為集中的中部區(qū)域。

將選取的3D-PSF以錐頂為中心，沿著z軸兩端等間隔離散采樣，獲得一系列的2D-PSF構(gòu)成新的3D-PSF，并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)修正，以免破壞3D-PSF的整體性。其中，每個(gè)3D-PSF僅層距不同，層數(shù)和徑向大小相同。

可以預(yù)測(cè)，3D-PSF的層距太小或者太大都無(wú)法得到最佳復(fù)原效果，復(fù)原效果與層距的關(guān)系曲線呈現(xiàn)倒U的形狀。即在相同層數(shù)和徑向大小的3D-PSF下，圖像復(fù)原效果隨著3D-PSF層距增大而提高，當(dāng)3D-PSF層距增大到臨界值時(shí)，圖像復(fù)原效果隨著3D-PSF層距增大而下降。這是因?yàn)椋?dāng)3D-PSF的層數(shù)固定時(shí)，層距太小使得3D-PSF的空間區(qū)域過(guò)小，只包含靠近焦面2D-PSF兩側(cè)的2D-PSF，無(wú)法有效地去除焦面的鄰近平面造成的散焦信息，取得最佳復(fù)原效果，層距太大使得3D-PSF的空間區(qū)域過(guò)大，3D-PSF兩端的部分2D-PSF遠(yuǎn)離焦面2D-PSF，無(wú)法有效還原焦面的細(xì)節(jié)，復(fù)原效果作用不大，甚至引起失真。

根據(jù)上述的分析，本文在三種不同的放大倍數(shù)下，使用不同層數(shù)的細(xì)胞樣本切片，研究不同層距，相同層數(shù)和徑向大小的3D-PSF與圖像復(fù)原效果的關(guān)系。

2實(shí)驗(yàn)與分析

2.1制作3D-PSF

設(shè)顯微鏡物鏡參數(shù)：放大倍數(shù)M=40，數(shù)值孔徑NA=0.65；顯微鏡機(jī)械鏡筒長(zhǎng)度為160 mm；光源波長(zhǎng)為550 nm；CCD參數(shù)為1/3英寸，像素值為640×480。

2.1.1制作顯微鏡物鏡光學(xué)系統(tǒng)3D-PSF

根據(jù)光學(xué)傳遞函數(shù)制作一個(gè)直徑為91(91×91)、層數(shù)為91、軸向采樣間隔Δz(以下簡(jiǎn)稱(chēng)層距)為0.025 μm的光學(xué)系統(tǒng)3D-PSF，命名為h10，其中h10的40指放大倍數(shù)，大小為91×91×91。

2.1.2制作用于復(fù)原的層距不同層數(shù)相同的3D-PSF

對(duì)h10進(jìn)行等間隔采樣，獲得徑向大小、層數(shù)均為15的3D-PSF(15×15×15)，層距分別為Δz1=0.025 μm、Δz2=0.05 μm，…，Δz24=0.6 μm，分別命名為h10_0025、h10_005，…，h10_06，其中h10_0025中的40指放大倍數(shù)，0025指層距0.025 μm，得到一系列不同層距的h15.15.15[11-12]。

2.2制作三維仿真樣本

圖1為清晰圖像、三種不同放大倍數(shù)下的模糊圖像和復(fù)原圖像。

使用圖1(a)所示的清晰圖像(151×151,256灰度級(jí))作為初始的二維樣本，通過(guò)旋轉(zhuǎn)方式制作出351幅相互關(guān)聯(lián)的二維圖像，并將這351幅圖像構(gòu)建為三維清晰圖像f(151×151×351)，分別將f與h10卷積得到三維仿真模糊切片圖像g40，大小為151×151×351，層距為0.025 μm，圖1(b)是位于g40中間層的圖像。

分別用層距為Δz1、Δz2，…，Δz24對(duì)g40進(jìn)行等間隔軸向采樣，采樣層數(shù)均為13層，得到第一組不同層距、相同層數(shù)和徑向大小的三維模糊切片圖像，分別命名為g40_13_0025、g40_13_005，…，g40_13_06,其中g(shù)40_13_0025的40指放大倍數(shù)，13指模糊切片層數(shù)，0025指層距0.025 μm，大小均為151×151×13。

同理，將采樣層數(shù)增加為19層、25層、31層時(shí)，得到得到另外三組模糊切片圖像，最大的層距分別為0.4 μm、0.35 μm和0.25 μm。

2.3仿真實(shí)驗(yàn)和結(jié)果分析

2.3.1圖像復(fù)原

分別將四組三維模糊切片圖像與相應(yīng)層距的h15.15.15進(jìn)行去卷積復(fù)原處理。采用經(jīng)典的復(fù)原算法：最大似然法[13-14]，迭代次數(shù)為500次，分別記錄復(fù)原時(shí)間，復(fù)原結(jié)果圖像分別命名為fi40_13_0025、fi40_13_005等，fi40_13_0025中的40指放大倍數(shù)，13指模糊切片層數(shù)。0025指層距0.025 μm，圖1(c)為fi40_13_05的中間層復(fù)原圖像。

同理，將顯微鏡物鏡參數(shù)依次修改為:①放大倍數(shù)M=20，數(shù)值孔徑NA=0.45。②放大倍數(shù)M=10，數(shù)值孔徑NA=0.25，其他條件不變?cè)俅芜M(jìn)行仿真實(shí)驗(yàn)。

2.3.2不同層距的3D-PSF復(fù)原結(jié)果圖像的改善信噪比

對(duì)得到的三維復(fù)原結(jié)果圖像使用公式(2)進(jìn)行改善信噪比ISNR計(jì)算。

(2)

其中：f、g和fi分別是三維清晰圖像、三維模糊圖像和三維復(fù)原結(jié)果圖像(151×151)。ISNR值越大，表明圖像的復(fù)原效果越好。

(a) f

(b) g40

(c) fi40_13_05

(d) g20

(e) fi20_13_0025

(f) fi20_13_06

(g) g10

(h) fi10_13_0025

(i) fi10_31_0175

圖2為不同放大倍數(shù)、不同層數(shù)模糊切片圖像下，相同層數(shù)和徑向大小的3D-PSF層距與三維復(fù)原圖像的ISNR關(guān)系曲線。

2.3.3結(jié)果分析

①對(duì)比圖2(a)～圖2(c)的曲線圖可以看出，使用相同層距的h15.15.15對(duì)圖像復(fù)原時(shí)，放大倍數(shù)越大，復(fù)原效果越好。同時(shí)，40倍時(shí)，ISNR曲線最先呈現(xiàn)出倒U的形狀。這是因?yàn)樵?D-PSF能量分布中，相同空間大小的3D-PSF，放大倍數(shù)越大，它所包含的能量越多，復(fù)原效果越好。

②從圖2(a)可以看出，M=40倍時(shí)，ISNR曲線在Δz=0.1 μm處，得到最小值，隨著層距的增加，ISNR曲線上升，在層距為0.5 μm處取得最大值，復(fù)原圖像如圖1(c)所示，繼續(xù)增大層距，ISNR曲線下降，總體趨勢(shì)呈現(xiàn)一個(gè)倒U的形狀。這說(shuō)明適當(dāng)增大3D-PSF的層距，可以提高圖像的改善信噪比。當(dāng)層距過(guò)小時(shí)，h15.15.15的空間區(qū)域過(guò)小，只包含靠近焦面2D-PSF兩側(cè)的2D-PSF，無(wú)法有效去除焦面附近平面造成的模糊效果，復(fù)原效果不理想。增大層距，h15.15.15的空間區(qū)域隨之增大，包含的2D-PSF攜帶更多的復(fù)原信息，圖像清晰度逐漸改善最終得到最佳復(fù)原效果。再增大層距時(shí)，構(gòu)成h15.15.15的部分2D-PSF遠(yuǎn)離焦面2D-PSF，復(fù)原作用減小，復(fù)原效果開(kāi)始下降。

(a)M=40

(b) M=20

(c) M=10

③圖2(b)中的曲線可以看出，M=20倍時(shí)，使用相同的h15.15.15復(fù)原19層、25層和31層的模糊切片，ISNR曲線在Δz=0.025 μm處取得最大值，在Δz=0.3 μm附近取得最小值，隨著層距的增加，ISNR曲線呈上升趨勢(shì)。這是因?yàn)榉糯蟊稊?shù)越小，3D-PSF能量在z軸方向上擴(kuò)散程度越大，h15.15.15需要更大的層距才能包含有用的2D-PSF用于復(fù)原焦面圖像，所以ISNR曲線逐漸上升，同時(shí)ISNR最大值將在較大的層距(Δz>0.5 μm)取得，層距繼續(xù)增大，h15.15.15包含的2D-PSF無(wú)法有效復(fù)原焦面圖像，ISNR曲線下降。

④在圖2(c)中，10倍的復(fù)原效果曲線總體呈下降趨勢(shì)，在Δz<0.6 μm時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，這是因?yàn)橄啾?0倍和20倍，10倍的3D-PSF能量在z軸方向上擴(kuò)散程度最大，能量更加分散。在層距較小時(shí)，采樣的2D-PSF過(guò)于相近，無(wú)法精確反映3D-PSF的能量分布。此時(shí)，將h15.15.15與相應(yīng)層距的三維切片模糊圖像進(jìn)行處理時(shí)，復(fù)原效果惡化，ISNR曲線下降。依據(jù)M=10倍時(shí)3D-PSF的能量分布，隨著層距的增大，10倍的ISNR曲線將會(huì)上升，同時(shí)取得最大值的層距比20倍的層距更大。

⑤圖2(b)中13層模糊切片與其他不同切片層數(shù)的ISNR曲線不同，一直呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)椋瑘D像的復(fù)原不僅與3D-PSF函數(shù)相關(guān)，也與切片的采樣數(shù)量有關(guān)。如圖1(f)所示在Δz=0.6 μm處，由于切片采樣過(guò)少，3D-PSF無(wú)法有效還原鄰近切片對(duì)焦面引起的散焦信息，復(fù)原效果不好。所以合適增加切片的采樣，有助于模糊圖像的復(fù)原。同理，在圖2(c)中，由于切片采樣層數(shù)多，使用相同的3D-PSF復(fù)原時(shí)，25層、31層切片的中間層模糊圖像在Δz=0.2 μm附近取得較好的復(fù)原效果，如圖1(i)所示。

研究結(jié)果表明，M=40時(shí)，3D-PSF層距為0.5 μm，圖像可以得到最佳的復(fù)原效果，M=20和M=10時(shí)，3D-PSF層距為0.025 μm，可以獲得較高的改善信噪比，如圖1(e)和圖1(h)。放大倍數(shù)為20倍、10倍時(shí)，ISNR曲線具體在多大的層距完整呈現(xiàn)出現(xiàn)倒U形，將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

3結(jié)語(yǔ)

為研究三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距與圖像復(fù)原的關(guān)系,通過(guò)仿真實(shí)驗(yàn),在三種不同放大倍數(shù)下，使用不同層距，相同層數(shù)和徑向大小的3D-PSF與相應(yīng)層距的三維仿真模糊圖像去卷積,獲得3D-PSF層距與三維圖像復(fù)原效果的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明，層距小于0.6 μm時(shí)，放大倍數(shù)為40倍，圖像在層距為0.5 μm處取得最佳復(fù)原效果，放大倍數(shù)為20倍和10倍時(shí)，圖像在層距為0.025 μm處取得較好的復(fù)原效果。本文研究結(jié)果為生物細(xì)胞切片的采樣和三維顯微圖像復(fù)原實(shí)際應(yīng)用中對(duì)3D-PSF的層距選取提供了參考，進(jìn)一步提高3D-PSF空間大小與采樣密度選取的科學(xué)性和確定性。

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(責(zé)任編輯梁碧芬)

收稿日期：2016-01-07；

修訂日期：2016-03-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61164019)；廣西科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053216)

通訊作者：陳華(1958—)，廣西桂平人，廣西大學(xué)教授；E-mail: chenhua_cn@163.com。

doi:10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.0810

中圖分類(lèi)號(hào)：TP391

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7445(2016)03-0810-06

On the relationship between the layer distance of three dimensional point spread function and image restoration

LIANG Ri-liu, CHEN Hua, MO Chun-qiu, NIE Xiong

(School of Computer, Electronics and Information, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract:In order to study the relationship between the three dimensional point spread function and the image restoration, the structure of 3D-PSF and the relationship between the effect of different layer distance and image restoration of digital confocal optical microscope imaging system are analyzed in theory. The relationship between the 3D-PSF of different distance and same layer number and radial amount is studied in different magnifications. Simulation results show that the best image restoration effect is obtained at the layer distance of 0.5 μm when the distance is less than 0.6 μm and the magnification is 40 times. When the magnification is 20 times or 10 times, better image restoration is achieved at the layer distance of 0.025 μm. The research results provide a theoretical basis for the selection of 3D-PSF layer distance in the practical application of the collection of cell sections and the practical application of three dimensional microscopic image restoration.

Key words:three dimensional point spread function(3D-PSF); image restoration; layer distance;sampling; improved signal to noise ratio (ISNR)

引文格式： 梁日柳，陳 華，莫春球.三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)層距與圖像復(fù)原的關(guān)系[J].廣西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，41(3)：810-815.