松墨天牛寡糖基轉移酶亞基STT3B的克隆與表達分析

蔡紫玲，吳華俊，林 同

（華南農業大學林學與風景園林學院，廣東廣州 510642）

松墨天牛寡糖基轉移酶亞基STT3B的克隆與表達分析

蔡紫玲，吳華俊，林 同

（華南農業大學林學與風景園林學院，廣東廣州 510642）

為闡明松墨天牛寡糖基轉移酶亞基STT3B的結構特點和在不同蟲態、成蟲的不同部位以及幼蟲組織中的表達情況，采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和快速擴增cDNA末端（RACE）技術克隆松墨天牛STT3B基因cDNA，命名為MaSTT3B，其GenBank登錄號為KT362368。序列分析顯示其長度為2 552 bp，其中開放閱讀框長2 322 bp，編碼773個氨基酸。MaSTT3B的氨基酸序列與赤擬谷盜相似性最高，為93%，在系統發育樹的同一個分支上。用實時熒光定量PCR分析MaSTT3B的相對表達量，結果表明：STT3B在蛹中的表達量高于成蟲；在成蟲足的表達量最高；在幼蟲各組織中，體壁的相對表達量最高。

松墨天牛；STT3B；基因克隆；RT-qPCR

真核寡糖基轉移酶（OST）位于內質網（ER）腔內，參與多肽N-糖基化的催化，是一種高度保守的蛋白質［1］。一系列的研究發現酵母和脊椎動物的OST包含了7或8個亞基（酵母：Ost1p、Ost2p、Ost3p/Ost6p、Ost4p、Ost5p、Stt3p、Wbp1p和Swp1p；脊椎動物：ribophorin I、DAD1、N33/IAP、OST4、STT3A/STT3B、Ost48和ribophorin II）［2］。其中，哺乳動物細胞的催化亞基STT3A和STT3B是一組輔助單元［3］，其酶動力學特性和底物都不同，但在N-糖基化時有部分功能重疊［4］。STT3A緊鄰蛋白易位通道，保證NXT/S位點的共翻譯糖基化，STT3B則修正STT3A遺漏的受體位點［5］。

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛，屬于鞘翅目（Coleoptera），天牛科（Cerambycidae），是重要檢疫性有害生物松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner&Buhrer））的主要傳播媒介［6-7］。

近年來，國內外對酵母、植物、人類和哺乳動物的OST及其各亞基的克隆、表達和功能結構等研究較多，而昆蟲STT3B的研究未見報道。本試驗通過對松墨天牛STT3B基因進行克隆及表達分析，為研究STT3B在昆蟲中的功能奠定基礎理論，為糖基化修飾研究提供有力支持。

1 材料和方法

1.1 供試天牛

松墨天牛采集于廣州市從化區馬尾松次生林，使用人工飼料飼養［8］。分別收集交配期成蟲的頭（去除觸角）、胸、足、翅、觸角、腹節等樣品；以及松墨天牛的3齡幼蟲及其體壁、脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等樣品；同時收集10 d蛹及羽化3 d的松墨天牛成蟲。樣品置于液氮中迅速冷卻后，放于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅡ總RNA提取試劑盒為OMEGA公司產品；IPTG、X-Gal等試劑購自上海生工生物工程有限公司；PrimeScript RT reagent Kit W ith gDNA Eraser反轉錄試劑盒、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒、pMD20-T Vector試劑盒、E.coli DH5αCompetent Cells、SYBR Premix Ex TaqTM實時熒光定量試劑盒等試劑為TaKaRa公司產品；通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生物有限公司。

1.3 總RNA提取和反轉錄

采用RNA抽提試劑盒說明書的方法來提取松墨天牛各樣本的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行檢測，以及微量紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）對RNA濃度進行檢測后，確定RNA質量和濃度符合試驗要求，置于-80℃冰箱保存備用。按PrimeScript RT reagent KitW ith gDNA Eraser反轉錄說明書將RNA反轉錄為單鏈cDNA，稀釋10倍用作實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的模板。

1.4 引物設計

從昆蟲分子生物學實驗室已構建的松墨天牛cDNA文庫［9］中篩選出一段糖基轉移酶亞基基因STT3B序列，以此序列為基礎，利用Primer prem ier 5.0軟件設計引物，Outer：5′-GAGTTGGTGGGATT ATGGG-3′和Inner：5′-AGGACATTAGGGAAAGCG-3′用于3′RACE；設計引物Forward（正向）：5′-CATA CGGAAGCGATGGAACT-3′和Reverse（反向）：5′-CC CATAATCCCACCAACTCA-3′，用于RT-qPCR。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.5 松墨天牛STT3B的3′RACE擴增及序列分析

1.5.1 3′RACE擴增 以合成的cDNA為模板，加入10×Ex Taq聚合酶反應緩沖液2.5μL（含Mg2+），正向和反向引物各0.5μL（10μmol/L），dNTP 2μL（2.5μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），加ddH2O至25μL，混勻離心（3 000 r/min 10 s）后進行PCR擴增。

將特異性引物Outer及試劑盒中提供的通用引物1進行第1輪PCR，反應條件為：94℃預變性3 min；94℃30 s，55℃30 s，58℃30 s，72℃1 m in，20個循環；72℃延伸10 m in。特異性引物Inner及通用引物2進行第2輪PCR。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 m in，30個循環；72℃延伸10 m in。反應結束后，取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5.2 基因克隆及序列測定 3′RACE產物通過回收純化后進行pMD20-T克隆載體連接過夜，再轉化到感受態大腸桿菌DH5α中，37℃培養箱培養重組質粒12 h，經氨芐青霉素和藍白斑進一步篩選，挑取白斑質粒培養3 h后，提取白斑質粒進行DNA檢測。測序交給上海生物工程有限公司完成。

1.5.3 核苷酸序列及其編碼氨基酸序列分析 測定序列拼接完成后，先用Blast程序（http：//blast.stva.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行相似性比對分析，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/gorf/）搜索開放閱讀框（ORF），獲得一條帶有完整ORF且與昆蟲寡糖基轉移酶亞基STT3B同源的序列；用ProtParam tool（http：//web. expasy.org/protparam/）計算蛋白質的等電點與分子量，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析磷酸化位點，SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白質信號肽，DictyOGlyc 1.1 Serve（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）預測糖基化位點，ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質的疏水性，Coils（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.htm l）預測卷曲結構。

1.5.4 構建系統發育樹 從NCBI（http：//www. Ncbi.nlm.Nih.gov/）GenBank數據庫中檢索昆蟲STT3B的氨基酸序列，用DNAMAN軟件進行同源性比對；用ClustalX和MEGA 4.0軟件構建昆蟲STT3B系統發育樹（NJ法）。

1.6 實時熒光定量PCR

以微管蛋白（β-actin）基因為內參基因，無菌超純水為陰性對照，以松墨天牛STT3B在成蟲的表達量為標準參量來測定其在各蟲態和成蟲各部位的表達量，以松墨天牛STT3B在幼蟲的表達量為標準參量來測定其在幼蟲各組織的表達量。實時熒光定量PCR反應體系為10.0μmol/L的上、下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，10.0μL SYBR Premix Ex-Taq，加入ddH2O至20μL；設置ddH2O為陰性對照，每個樣本3次重復。放入LightCycler480熒光定量PCR儀擴增。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃復性20 s，進行40個循環；40℃冷卻30 s。反應結束后采集目標基因的Ct值和2個內參基因的Ct平均值，利用2-ΔΔCT相對定量法計算相對表達量［10］。

2 結果與分析

2.1 松墨天牛STT3B基因序列分析

本試驗克隆了松墨天牛糖基轉移酶基因cDNA，命名為MaSTT3B（GenBank登錄號：KT362368），全長2 552 bp（圖1），其中包含開放閱讀框（ORF）2 322 bp， 230 bp的3′端非編碼區，ORF編碼773個氨基酸殘基，推測的分子式為C4061H6171N1013O1091S25，分子量為87.442 3 kDa，等電點為8.91，穩定系數為63.14，為穩定蛋白。疏水性最大值為3.933，最小值為-3.001，是親水蛋白。MaSTT3B有8個蘇氨酸磷酸化位點，26個絲氨酸磷酸化位點，10個酪氨酸磷酸化位點，無糖基化位點、螺旋卷曲和信號肽。

2.2 序列相似性和系統發育樹

將MaSTT3B氨基酸序列與NCBI數據庫中的17種昆蟲STT3B的氨基酸序列進行同源性比對（圖2），其中，STT3B與赤擬谷盜相似性最高，為93%，與內華達古白蟻的相似性為84%，與其他昆蟲的相似性都大于75%。大多數膜翅目昆蟲的STT3B亞基由約800個氨基酸組成，而雙翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲則由約770個氨基酸組成。本研究克隆的松墨天牛STT3B的開放閱讀框全長2 322 bp，能編碼773個氨基酸殘基，而其親緣關系最近的赤擬谷盜STT3B的編碼區能編碼了776個氨基酸。

圖1 MaSTT3B的核苷酸及其編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and encoding am ino acid sequences of MaSTT3B

圖2 松墨天牛與其他16種昆蟲STT3B編碼氨基酸序列比對Fig.2 Am ino acid sequence alignm ent of STT3B from M.alternatus and other insects

圖3 基于昆蟲寡糖基轉移酶亞基STT3B氨基酸序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic relationships of insects based on STT3B am ino acids

基于18種昆蟲的寡糖基轉移酶亞基STT3B序列構建的系統進化樹顯示（圖3）：松墨天牛與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）遺傳距離最近，在同一分支；與歐洲熊蜂（Bombus terrestris）等遺傳距離較遠。

2.3 松墨天牛STT3B的表達分析

用熒光定量RCR法分析了STT3B在松墨天牛不同蟲態、成蟲各部位和幼蟲各組織的表達模式。MaSTT3B在蛹的表達量最高，幼蟲的表達量最低，蛹和幼蟲的相對表達量分別是成蟲的1.10，0.17倍，基因表達在三者之間差異顯著（P＜0.05）（圖4）。成蟲各部位的表達模式為：足的表達量最高，為對照（對照值為1）的11.55倍，翅膀的表達量最低，為對照的0.12倍，頭、胸、腹、觸角分別為對照的2.60，2.79，2.13，0.53倍，成蟲各部位MaSTT3B基因表達有顯著差異（P＜0.05）（圖5）。幼蟲各組織的表達模式為：體壁的表達量最高，為對照的30.27倍，中腸的表達量最低，為對照的0.10倍，脂肪體、血淋巴、馬氏管分別為對照的3.58，1.14，0.30倍，幼蟲各組織MaSTT3B基因表達有顯著差異（P＜0.05）（圖6）。圖4-6中數據為平均數±標準誤；柱上不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

圖4 STT3B在松墨天牛不同蟲態的表達Fig.4 The expression of STT3B in various instars of M.alternatus

圖5 STT3B在松墨天牛成蟲不同部位的表達Fig.5 The exp ression of STT3B in different parts of M.alternatus adu lt

圖6 STT3B在松墨天牛幼蟲不同組織中的表達Fig.6 The exp ression of STT3B in various tissues of M.alternatus larvae

3 討論

STT3是一個高度保守的亞基，它含有一個Ncyt-Clum拓撲結構和11個跨膜螺旋［11］，3′端有WWDYG與DK 2個保守的基序［12］，可分為STT3A和STT3B 2個亞基。本試驗采用RACE技術獲得了松墨天牛一段完整序列，通過Blast比對，發現比對的序列都為STT3B，其中以已測定基因組的赤擬谷盜最為相似，相似性達到93%，與其他昆蟲氨基酸序列的相似性在75%以上，因此可確定該序列為STT3B，命名為MaSTT3B。大多數膜翅目昆蟲的STT3B亞基由約800個氨基酸組成，而雙翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲則由約770個氨基酸組成。本試驗克隆的松墨天牛STT3B的開放閱讀框全長2 322 bp，能編碼773個氨基酸殘基，而其親緣關系最近的赤擬谷盜STT3B的編碼區能編碼了776個氨基酸。

N-糖基化有調節蛋白質功能的作用，更有少數蛋白需要N-糖基化才可表達其正常功能，比如內肽酶［13］、GD3合酶（α-2，8-唾液酸基轉移酶）［14］、GM2合酶（β-1，4-N乙酰半乳糖氨基轉移酶）［15］和高親和性免疫球蛋白E受體等［16］。寡糖基轉移酶（OST）作為參與蛋白質糖基化過程的多種酶之一，含有7或8個亞基，但僅有催化亞基STT3A和STT3B有催化功能，能催化核心寡糖由多萜醇二磷酸核心寡糖轉移至新合成肽鏈的NXS/T序列中的天冬酰胺殘基上形成N-糖苷鍵。NXS/T序列是蛋白質N-糖基化的標志，分別為天冬氨酸-X-絲氨酸/蘇氨酸（Asn-X-Ser/Thr），X可以是除了脯氨酸（Pro）外的任何氨基酸。Malaby等［17］發現在糖基化過程中，如果NXS位點含有大量的疏水性和帶負電荷的殘基，STT3A和STT3B就無法作用這些位點。

鑒于糖基化的重要性，OST亞基STT3B一直是研究的熱點。但目前，STT3B的研究集中在結構和功能上，多以酵母、小鼠等為試材，并未有涉及昆蟲領域。在糖基化過程中，糖鏈不僅需要糖基轉移酶的作用，還要具有位點特異的性質，也即是要有糖基化位點［18-19］。那么STT3B本身是否含有糖基化位點呢？經分析，MaSTT3B無糖基化位點、信號肽。比較本試驗中的其他16種昆蟲的STT3B，除了麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）在438位的絲氨酸含有一個糖基化位點外，其他都無糖基化位點和信號肽，可見STT3B在結構上比較保守，一般不含糖基化位點和信號肽，這可能跟其功能相適應。

STT3B能修飾STT3A在糖基化過程中的遺漏位點，特別是蛋白序列C末端。Shrimal等［20］表明糖基化氨基酸序列的C端和內部的糖基化位點（NXT/NXS）功能相同，一般由STT3B修飾，而不是STT3A。同時，STT3B參與內質網介導的降解途徑，但其具體機制有待于進一步分析。

本試驗克隆了MaSTT3B基因，分析了該基因編碼氨基酸序列特征，并采用RT-PCR技術對其在松墨天牛各發育時期和各組織的表達差異性進行了分析，發現MaSTT3B在蛹、足、體壁等的表達量較高。蛹是幼蟲轉變為成蟲的過渡狀態，體內組織發生各種生理活動，新陳代謝比幼蟲和成蟲更快。足是運動器官，肌肉發達，含有大量蛋白質。體壁起著保護作用，含較多的幾丁質和蛋白質。因此，筆者猜測是由于在這三者中蛋白質合成代謝較為活躍，需要更多的STT3B參與N-糖基化。當然，STT3B在松墨天牛中的具體功能還需要更進一步地深入研究。

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Cloning and Expression Analysis of STT3B of O ligosaccharyltransferase from Monochamus alternatus

CAIZiling，WU Huajun，LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

In order to analyze the structure characteristics of MaSTT3B and its expression in the different development stages，different parts of adults and different tissues in larvae，we cloned the STT3B gene of Monochamus alternatus named MaSTT3B（GenBank accession number：KT362368）using the technology including reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid amplification（RACE）.The total sequence length of MaSTT3B is 2 552 bp，including 2 322 bp open reading frame encoding 773 am ino acids.The am ino acid sequence of MaSTT3B has 93%similarity to Tribolium castaneum，and both of them are in the same branch of phylogenetic tree based on insect STT3B.The result of RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.The relative expression levels of MaSTT3B was detected by RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.

Monochamus alternatus；STT3B；Gene cloning；RT-qPCR

Q966；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0080-08

10.7668/hbnxb.2016.03.012

2016-03-12

國家自然科學基金項目（31470653）；廣東省自然科學基金項目（1414050001666）

蔡紫玲（1992-），女，廣東茂名人，在讀碩士，主要從事昆蟲分子生物學研究。

林 同（1969-），男，黑龍江通河人，副教授，博士，主要從事昆蟲分子生物學研究。