普洱茶對非酒精性脂肪肝大鼠腸道脂肪吸收及粘膜屏障的干預研究

朱晟易，童鈺鈴，趙奕，呂海鵬，林智，沈國麗，孫婷，宋震亞*

普洱茶對非酒精性脂肪肝大鼠腸道脂肪吸收及粘膜屏障的干預研究

朱晟易1，童鈺鈴1，趙奕1，呂海鵬2，林智2，沈國麗1，孫婷1，宋震亞1*

1. 浙江大學醫學院附屬第二醫院，浙江 杭州 310009；2. 農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

摘要：研究了普洱茶調控非酒精性脂肪肝大鼠腸道對長鏈脂肪酸的吸收，并探討了其可能機制。將 36只 SD大鼠隨機分成正常對照組、脂肪肝模型組和普洱茶干預組，每組12只。實驗第8周末處死所有大鼠，測定大鼠體質量、肝指數及血清血脂水平；采用定量 PCR測定大鼠腸道黏膜脂質吸收相關蛋白細胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）、緊密連接相關蛋白如閉鎖蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白（Zonula occludens 1，ZO-1）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）基因表達水平。研究結果表明，與模型組相比，普洱茶組大鼠體質量和血清 LDL-C水平分別下降了 16.12%和 42.59%；此外，普洱茶組大鼠小腸組織CD36、TNF-α表達水平明顯降低，而Occludin、ZO-1表達水平明顯升高。研究發現，普洱茶對NAFLD大鼠腸道長鏈脂肪酸吸收及腸道緊密連接蛋白有一定程度的調控作用，尤其是對NAFLD早期發生發展中游離脂肪酸過度沉積的“第一次打擊”有防治價值。

關鍵詞：普洱茶；非酒精性脂肪性肝病；脂質代謝；緊密連接

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種除外酒精因素或其他明確病理原因導致的以肝實質細胞脂質過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1］，為全球重要的肝病，也是中國第二大肝病，同時與肥胖、心腦血管疾病、糖尿病等的發生發展有密切關系。在NAFLD的發生發展過程中，過多游離脂肪酸沉積是“一次打擊”；蓄積的游離脂肪酸通過反應性氧化物對肝臟進行“二次打擊”，促使肝臟單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化發展［2］。采用非藥物手段改善早期肝臟脂質沉積是NAFLD防治工作中極其重要的一環。

腸道作為食物吸收的主要器官，在NAFLD的發生發展中可能起到重要的作用。脂肪消化后的主要成分中長鏈脂肪酸（Long chain fatty acids，LCFA）的吸收與小腸吸收細胞膜蛋白脂肪酸轉位酶細胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）密切相關［3］。另有研究顯示，NAFLD患者存在小腸粘膜上皮細胞緊密連接結構受損，腸道緊密連接蛋白（Tight junction proteins，TJPs）Occludin 和 ZO-1表達下調［4］，而上皮細胞 TNF-α表達水平上升［5］的現象，表明可能因為腸粘膜屏障功能減弱使更多細菌內毒素進入血液循環，通過一系列炎癥反應造成肝細胞損傷［6］。

茶葉是一種保健飲品，科學研究已經證實它在促進脂肪代謝、減輕體質量，以及減肥成功后的體質量維持等多方面均有良好的表現［7-10］。普洱茶是一種具有獨特風味的微生物發酵茶，關于普洱茶的功效備受關注［11-12］。研究表明，普洱茶能在降低SD大鼠血液中的LDL-C水平的同時提高 SD大鼠血液中的HDL-C水平，而綠茶、紅茶以及烏龍茶等只能同時降低二者的水平［13］。我們前期的研究發現，普洱茶能夠改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性［14］。然而，目前尚無關于普洱茶對NAFLD腸道影響的研究報道。因此，本實驗擬通過對大鼠體質量、肝濕重及血清血脂水平的變化，以及腸粘膜CD36、Occludin、ZO-1 和 TNF-α等基因表達的研究，來分析探討普洱茶對腸道脂肪吸收與粘膜屏障干預的可能機制，旨在為今后將普洱茶應用于非酒精性脂肪性肝病的防治提供科學依據和重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

普洱茶（熟茶，散茶，云南德宏志誠茶葉有限公司提供），膽固醇（杭州昊天生物技術有限公司），Trizol試劑、Realtime PCR引物［英濰捷基（上海）貿易有限公司］，ReverTra Ace?逆轉錄試劑盒、SYBR Green? Realtime PCR試劑［東洋紡（上海）生物科技有限公司］，分光 光度 計 （Nano Drop 1000， Thermo Scientific），RT-PCR儀（Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-Time PCR System）。

1.2 實驗方法

1.2.1 普洱茶茶水提取物的制備

按照 1︰15的茶水比例，將普洱茶在100℃沸水中浸提4次，每次持續10 min；將4次的提取液合并后，用脫脂棉過濾，最后將濾液經冷凍干燥，得到普洱茶水提物粉末，并將其置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 動物模型

SD大鼠，清潔級，4～5周齡，雄性，體質量（135±8） g，36只，上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2007-0005］提供。動物飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心［SYXK（浙）2008-0115］，室溫（23±2）℃，相對濕度60%～70%。

SD大鼠在實驗環境下適應性喂養 1周后，隨機分為3組：正常對照組、脂肪肝模型組、普洱茶干預組（分別簡稱對照組、模型組、普洱茶組），每組各12只。對照組給予普通飼料喂養，模型組和普洱茶組給予高脂飼料（84%普通飼料+14%豬油+2%膽固醇）喂養。從第5周起，普洱茶組每日分別給予普洱茶水提物 1.0 g·kg-1·d-1（根據體質量 60 kg成人每日普洱茶飲用量 10 g為標準以及提取過程中的水浸出物百分含量換算所得，計算公式：大鼠 的 劑 量 =10 g× 0.018/（0.2 kg）≈ 1.0 g·kg-1·d-1），經口灌胃，用蒸餾水稀釋，另外兩組每日給予等體積生理鹽水經口灌胃。實驗期間大鼠自由飲水和進食。

1.2.3 標本采集

第 8周末處死全部大鼠。處死前禁食 12 h，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭處死。腹主動脈插管取血3 mL后取出肝臟稱肝濕重并計算肝指數（肝指數=肝濕重/末次體質量×100%），取部分肝臟固定于4%中性福爾馬林液中。迅速剪取上段小腸，使用預冷的 0.9%鹽溶液清洗小腸標本內外，放于凍存管后存于-80℃冰箱。

1.2.4 大鼠血脂指標測定

采用全自動生化分析儀由浙江大學醫學院附屬第二醫院檢驗科生化室協助測定血清TG，TC，HDL-C，LDL-C。

1.2.5 肝組織油紅O染色

肝組織冰凍切片10 μm，油紅O染色10 min，蘇木素復染1 min，顯微鏡觀察。

1.2.6 小腸組織RT-PCR。

取100 mg小腸標本，按Trizol法提取組織總 RNA。提取得到的 RNA樣本按照ReverTra Ace?逆轉錄試劑盒說明操作制備complementary DNA（cDNA）用于RT-PCR，選用大鼠 GAPDH基因作為內參。本次實驗PCR所用引物通過查閱相關文獻及使用Primer Premier 5.0獲得（表1）。

1.3 統計學方法

表1 本實驗中使用的RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers used in this experiment

2 結果與分析

2.1 大鼠體質量、肝指數及血清血脂水平變化

普洱茶對大鼠體質量、肝指數及血清血脂水平的影響如表2和表3所示。模型組大鼠體質量、肝指數及血清LDL-C水平均明顯高于對照組（P＜0.01），血清TG、TC及HDL-C水平無明顯差異。與模型組相比，普洱茶組大鼠體質量和血清 LDL-C水平均顯著降低（P＜0.01）分別下降16.12%和42.59%，而肝指數及血清TG、TC及HDL-C水平無明顯差異（P＞0.05），說明普洱茶能減輕大鼠體質量，改善血清 LDL-C水平，具有明顯的減肥、降脂作用。

表2 普洱茶對大鼠體質量、肝指數的影響Table 2 Effect of Pu-erh tea on body weight and liver index in NAFLD rats

表3普洱茶對大鼠血清血脂水平的影響Table 3 Effect of Pu-erh tea on serum TG， TC， HDL-C， LDL-C level in NAFLD rats

2.2 大鼠肝臟病理學的變化

采用油紅 O染色各組大鼠肝組織脂肪沉積的情況如圖1所示。從圖1可以觀察到，與正常飼料組比較，模型組大鼠肝細胞內脂滴呈彌漫性、顆粒狀堆積，脂滴明顯增大；普洱茶組大鼠肝細胞脂滴數量明顯減少，散在稀疏，脂滴體積較小，脂肪病變明顯改善；表明普洱茶對高脂引起的大鼠肝臟病理學的變化有明顯的抑制作用。

2.3 大鼠小腸粘膜CD36 mRNA表達水平的變化

CD36主要存在于十二指腸和空腸，與小腸 LCFA吸收密切相關，其表達上調有利于LCFA轉運入小腸細胞。由圖2可知，模型組大鼠小腸組織 CD36 mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.01），提示進食高脂飲食能夠促進小腸吸收細胞膜蛋白 CD36表達代償性上調，從而導致腸道中LCFA大量進入小腸細胞內，并最終轉運入肝臟。與模型組相比，普洱茶的 CD36 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）（圖2），提示普洱茶能夠一定程度下調小腸CD36的表達，減少從小腸上皮細胞膜外側轉運入細胞膜內側的LCFA，從而減少脂肪酸輸入肝臟，一定程度上起到降血脂和預防肝臟脂質沉積的作用。

2.4 大鼠腸粘膜緊密連接相關蛋白Occludin、

ZO-1 mRNA表達水平的改變

緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，位于相鄰小腸上皮細胞膜之間，在正常情況下阻隔內毒素等大分子物質進入血液循環，其功能的實現受TJPs（Occludin、ZO-1）表達的調控。上皮細胞間緊密連接結構受損與NAFLD密切相關，有研究發現NAFLD患者腸粘膜 Occludin、ZO-1表達下調［4］，小腸粘膜緊密連接結構破壞，粘膜通透性增大。而我們試驗中發現和對照組相比，模型組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平無明顯差異（P＞0.05），原因可能在于我們的模型組大鼠處于NAFLD病情早期階段，實驗結束時間可能尚未達到NAFLD大鼠小腸緊密連接功能改變的切點。普洱茶組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均顯著高于模型組（P＜0.01）（圖2），推測普洱茶能夠通過上調Occludin和ZO-1的表達，一定程度上加強大鼠小腸上皮細胞間緊密連接結構，起到預防及改善NAFLD的作用。

圖1 油紅O染色各組大鼠肝組織脂肪沉積情況（×200）Fig. 1 Observation of fat deposition in liver tissue by oil red O staining（×200）

圖2 普洱茶對大鼠小腸組織CD36、Occludin、ZO-1、TNF-α基因mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of Pu-erh tea on intestinal CD36， Occludin， ZO-1， TNF-αgene expressions in NAFLD rats

2.5 對大鼠小腸組織TNF-α基因mRNA表達的影響

既往研究發現 NAFLD模型小腸細胞TNF-α表達升高，促進誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達，使腸細胞一氧化氮（Nitric oxide，NO）合成增加［15］，從而下調小腸粘膜緊密連接蛋白的表達，小腸粘膜通透性增大，細菌內毒素大量進入血液循環［6］，到達肝臟后進一步造成肝臟的氧化損傷形成NAFLD“二次打擊”。模型組大鼠小腸組織TNF-α mRNA表達顯著高于對照組（P＜0.01），和既往的研究結論類似。普洱茶組大鼠小腸組織TNF-α mRNA表達水平均顯著低于模型組（P＜0.01）（圖2），說明普洱茶能夠抑制大鼠小腸組織TNF-α的表達，下調iNOS的表達，從而減少NO的產生，保護小腸上皮細胞間緊密連接結構，一定程度上改善腸上皮細胞通透率，阻止過多的 LPS通過門靜脈進入肝臟，并最終減少由過多 LPS導致的肝臟炎癥損害。

3 結論與討論

在NAFLD的發生發展過程中，早期肝臟的脂質沉積起到至關重要的作用［1］。過多游離脂肪酸的沉積對肝臟產生“一次打擊”；蓄積的游離脂肪酸通過反應性氧化物對肝臟進行“二次打擊”，促使肝臟單純性脂肪沉積向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化發展［1］。食物脂肪攝入，尤其是LCFA攝入增多是體內游離脂肪酸攝入的重要環節。小腸吸收細胞膜蛋白脂肪酸轉位酶 CD36定位于小腸絨毛細胞刷狀緣膜，與LCFA吸收密切相關［2］。本實驗中第8周末模型組大鼠小腸組織 CD36 mRNA表達水平較對照組明顯升高，提示進食高脂飲食能夠促進小腸吸收細胞膜蛋白 CD36表達代償性上調，從而導致腸道中LCFA大量進入小腸細胞內，并最終轉運入肝臟。我們的研究發現，和模型組相比，普洱茶組大鼠小腸組織CD36 mRNA表達量顯著降低，提示普洱茶能夠下調小腸CD36的表達，減少小腸細胞LCFA的轉運，從而減少肝臟脂肪酸的輸入，從而起到降低血脂和改善肝臟脂質沉積的作用。

緊密連接結構屬不通透連接，是小腸上皮細胞間的主要連接方式。正常情況下只允許水分子和離子從銜接處的小孔通過［16］，為最重要的腸粘膜屏障。目前已知的緊密連接相關蛋白主要有 Occludin［17］、ZO-1［18］等，其表達量調控著緊密連接的功能和腸上皮粘膜通透率。已有研究發現 NAFLD模型小腸細胞 TNF-α表達升高，促進iNOS的表達，使腸細胞一氧化氮合成增加［15］，增多的TNF-α及NO能夠下調小腸粘膜緊密連接蛋白的表達，造成粘膜緊密連接結構破壞，小腸粘膜通透性增大，腸道革蘭氏陰性菌產生的內毒素大量進入血液循環［6］，到達肝臟后進一步促進肝細胞TNF-α產生，誘導肝臟的氧化損傷形成NAFLD“二次打擊”，最終導致肝臟炎癥、壞死和纖維化。由此可見，小腸細胞 TNF-α水平及粘膜緊密連接結構受損與NAFLD密切相關。本研究再次證實了模型組小腸組織TNF-α mRNA水平高于正常對照組。而普洱茶組 TNF-α水平較脂肪肝模型組均明顯下調，說明普洱茶能夠抑制大鼠小腸組織 TNF-α的表達，進一步下調iNOS，從而減少NO的生成。既往文獻發現，NAFLD患者 Occludin和 ZO-1表達下調［4］，而我們的研究發現，和對照組相比，模型組大鼠小腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平無明顯差異，究其原因可能有以下幾點，一為我們的研究對象為 NAFLD早期階段造模大鼠，實驗結束時間可能尚未達到NAFLD大鼠小腸緊密連接功能改變的切點；第二可能存在其他緊密連接蛋白的影響，或者緊密連接蛋白在 NAFLD早期階段可能并不是數量上的改變，而是形態結構上的變化導致腸道通透性變化，需要進一步的探討。普洱茶組大鼠小腸粘膜 Occludin、ZO-1表達水平明顯升高，推測普洱茶能夠上調Occludin和ZO-1的表達，加強大鼠小腸上皮細胞間緊密連接結構，起到預防及改善NAFLD的作用。這些研究結果證實了普洱茶對非酒精性脂肪肝大鼠腸道脂肪吸收及粘膜屏障的干預作用，其機理有待于進一步的研究。

普洱茶屬于后發酵茶。微生物參與的后發酵加工過程奠定了普洱茶保健功效的化學物質基礎，其原料曬青毛茶中的化學成分在高溫高濕的環境中發生了復雜的生物轉化，形成了一系列決定普洱茶風味品質的關鍵品質化學成分以及生物活性成分，例如茶褐素［19］、普洱素（8-C取代的黃烷-3-醇成分）［20］、他汀類成分［21］、沒食子酸［22］、黃酮類成分［23-25］等。本文報道了普洱茶對調控NAFLD大鼠小腸組織相關基因表達的作用，但具體是由普洱茶中的哪種生物化學成分產生的，是否存在協同作用，這一系列的問題都具有重要的研究價值和研究意義。

參考文獻

［1]Wieland AC， Mettler P， McDermott MT， et al. Low awareness of nonalcoholic fatty liver disease among patients at high metabolic risk ［J］. J Clin Gastroenterol， 2015， 49（1）: e6-e10.

［2]Ogawa Y， Imajo K， Yoneda M， et al. Pathophysiology of NAsh/NAFLD associated with high levels of serum triglycerides ［J］. Nihon Rinsho， 2013， 71（9）: 1623-1629.

［3]Glatz JF， Luiken JJ， Bonen A. Membrane fatty acid transporters as regulators of lipid metabolism: implications for metabolic disease ［J］. Physiol Rev， 2010， 90（1）: 367-417.

［4]Miele L， Valenza V， La Torre G， et al. Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease ［J］. Hepatology， 2009， 49（6）: 1877-1887.

［5]Park EJ， Thomson AB， Clandinin MT. Protection of intestinal occludin tight junction protein by dietary gangliosides in lipopolysaccharide-induced acute inflammation ［J］. J Pediatr Gastroenterol Nutr， 2010， 50（3）: 321-328.

［6]Reid AE. Nonalcoholic steatohepatitis ［J］. Gastroenterology，2001， 121（3）: 710-723.

［7]陳宗懋， 甄永蘇. 茶葉的保健功能 ［M］. 北京: 科學出版社， 2014.

［8]Dulloo AG， Duret C， Rohrer D， et al. Efficacy of a green tea extract rich in catechin polyphenols and caffeine in increasing 24-h energy expenditure and fat oxidation in humans ［J］. Am J Clin Nutr， 1999， 70（6）: 1040-1045.

［9]Chen ZM， Lin Z. Tea and human health: biomedical functions of tea active components and current issues ［J］. J Zhejiang Univ Sci B， 2015， 16（2）: 87-102.

［10]Cao ZH， Gu DH， Lin QY， et al. Effect of pu-erh tea on body fat and lipid profiles in rats with diet-induced obesity ［J］. Phytother Res， 2011， 25（2）: 234-238.

［11]Hou Y， Shao W， Xiao R， et al. Pu-erh tea aqueous extracts lower atherosclerotic risk factors in a rat hyperlipidemia model ［J］. Exp Gerontol， 2009， 44（6/7）: 434-439.

［12]Lee LK， Foo K Y. Recent advances on the beneficial use and health implications of Pu-Erh tea ［J］. Food Research International， 2013， 53: 619-628.

［13]Kuo KL， Weng MS， Chiang CT， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats ［J］. J Agric Food Chem， 2005， 53（2）: 480-489.

［14]肖凱， 朱晟易， 童鈺鈴. 普洱茶水提取物對大鼠非酒精性脂肪性肝病的干預作用［J］. 第三軍醫大學學報， 2013: 35（18）: 1992-1995.

［15]Han X， Fink MP， Yang R， et al. Increased iNOS activity is essential for intestinal epithelial tight junction dysfunction in endotoxemic mice ［J］. Shock， 2004， 21（3）: 261-270.

［16]Harhaj NS， Antonetti DA. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology ［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2004， 36（7）: 1206-1237.

［17]許臘梅，孫丹莉，張予蜀. 緊密連接蛋白Occludin在非酒精性脂肪肝大鼠腸上皮細胞中的表達及其與 TNF-α的關系［J］. 世界華人消化雜志， 2010， 18（10）: 981-986.

［18]Fanning AS， Jameson BJ， Jesaitis LA， et al. The tight junction protein ZO-1 establishes a link between the transmembrane protein occludin and the actin cytoskeleton ［J］. J Biol Chem， 1998， 273（45）: 29745-29753.

［19]Liang Y， Zhang L. A study on chemical estimation of pu-erh tea quality ［J］. Journal of the science of food agriculture，2005， 95: 286-292.

［20]Zhou ZH， Zhang YJ， Xu M， et al. Puerins A and B， two new 8-C substituted flavan-3-ols from Pu-er tea ［J］. J Agric Food Chem， 2005， 53（22）: 8614-8617.

［21]Yang DJ， Hwang LS. Study on the conversion of three natural statins from lactone forms to their corresponding hydroxy acid forms and their determination in Pu-Erh tea ［J］. J Chromatogr A， 2006， 1119（1/2）: 277-284.

［22]呂海鵬， 林智， 谷記平， 等. 普洱茶中的沒食子酸研究［J］.茶葉科學， 2007， 27（2）: 104-110.

［23]Lv H， Zhu Y， Tan J， et al. Bioactive compounds from Pu-erh tea with therapy for hyperlipidaemia ［J］. Journal of Functional Foods， 2015， 19: 194-203.

［24]呂海鵬， 谷記平， 林智， 等. 普洱茶的化學成分及生物活性研究進展［J］. 茶葉科學， 2007， 27（1）: 8-18.

［25]東方， 楊子銀， 何普明， 等. 普洱茶抗氧化活性成分的LC-MS分析［J］. 中國食品學報， 2008， 8（2）:133-141.

中圖分類號：TS272.5+4；R972+.6

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-237-08

收稿日期：2015-12-21

修訂日期：2016-01-25

基金項目：中醫藥重點研究計劃（2012ZZ011）

作者簡介：朱晟易，男，碩士研究生，主要從事非酒精性脂肪性肝病早期預防和治療的研究。*通訊作者：songzy@medmail.com.cn

Effect of Pu-erh Tea on Long Chain Fatty Acid Metabolism and Expression of Tight Junction Proteins in the Rat Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease

ZHU Shengyi1， TONG Yuling1， ZHAO Yi1， Lü Haipeng2， LIN Zhi2，SHEN Guoli1， SUN Ting1， SONG Zhenya1*
1. The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou 310009， China；2. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture， Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China

Abstract:In this study， the influence of Pu-erh tea on the absorption of long chain fatty acids in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats was analyzed. Moreover， the possible interventional mechanism was also discussed. Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups， normal group （NG）， NAFLD group， and Pu-erh tea group （PTG）， 12 rats for each group. All rats were killed after 8 weeks. Rat weight， liver index， serum lipid level，intestinal lipid absorption protein （CD36）， tight junction proteins （Occludin， ZO-1）， and TNF-α mRNA were measured.Compared with NAFLD group， rat weight and serum LDL-C in PTG were decreased by 16.12% and 42.59%， respectively. In addition， the expressions of CD36 and TNF-α mRNA in PTG were decreased， while occludin and ZO-1 mRNA expressions were increased. Our results suggest that Pu-erh tea can regulate the intestinal absorption of long chain fatty acids and the tight junction proteins in rats， and it is especially effective in prophylaxis against ‘the first attack’in the early stage of NAFLD.

Keywords:Pu-erh tea， nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， lipid metabolism， tight junction