大杯蕈組織分離部位的優選研究

黃先洲，林新堅

（1.寧德職業技術學院，福建福安　355000；2.福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建福州　350003）

大杯蕈組織分離部位的優選研究

黃先洲1，林新堅2

（1.寧德職業技術學院，福建福安355000；2.福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建福州350003）

為了確定大杯蕈組織分離的最佳部位，同時也為人工制種提供依據，對大杯蕈子實體4個不同組織分離獲得的菌絲進行生長量、抗逆性和抗污染能力測定試驗。經綜合比較分析，結果表明，菌柄中上部組織是大杯蕈母種組織分離的最佳選擇。

大杯蕈；組織分離部位；菌絲生長量；抗逆性；抗污染

0　引言

大杯蕈（Clitocybe maxima） 又名大杯傘，大漏斗菌，隸屬于口磨科 （Trichlilmataceae），杯傘屬（Clitocybe）［1］，味道鮮美、香味獨特，是高溫淡季豐富食用菌市場的珍稀菌類，有良好的發展前景。本試驗對大杯蕈不同部位組織進行分離獲得菌絲，并對其生長量、生長勢，以及抗不良環境能力和抗雜菌污染能力進行了系列試驗，以探求大杯蕈最佳的組織分離部位。

1　試驗材料和方法

1.1供試菌株

新鮮大杯蕈優質子實體，無菌操作挑取子實體不同部位綠豆大小的內部組織，接入PDA試管培養基斜面中央，27℃下室溫培養菌絲，純化轉管后分別獲得A，B，C，D 4個供試菌株。

子實體分離部位選擇與標記見圖1。

1.2供試培養基

圖1　子實體分離部位選擇與標記

PDA培養基：馬鈴薯200 g，水1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g［2］。

固體培養基：木屑39%，棉籽殼34%，麥麩22%，玉米粉3%，葡萄糖1%，輕質碳酸鈣1%，含水量65%［3］。

1.3供試接種塊置備

在PDA培養基滅菌后，取40 mL倒入250 mL的錐形瓶中，水平實驗臺自然冷卻，凝固成PDA平板培養基，冷卻后中央接種供試菌株，27℃室溫培養14 d，統一在菌落外緣用直徑5 mm打孔器打孔，獲取無誤差的供試接種塊。

1.4不同組織分離部位的菌絲生長速度比較試驗

1.4.1試驗設計

單因素4個水平4個重復設計。即選用固體培養基，接種A，B，C，D 4種供試菌株，27℃室溫培養，劃線法測定菌絲生長量［4］。

1.4.2試驗方法

將配制好的培養料稱取42 g，等量填入25 mm× 200 mm試管內，共計20根。取略小于管口的小木棒統一向下壓實4.5 cm，以保證每根試管內培養基有相同的松緊度。再抽出木棒，洗凈管口，擦干，塞上棉花塞，置于手提高壓鍋中進行滅菌，壓力為0.15 kPa，滅菌時間維持1 h。培養基冷卻后，用大小一致、菌絲密度一致、菌齡一致的供試接種塊接種，菌絲長滿料面后劃起始線，以后每隔3 d在菌絲先端劃一次走菌線，測量15 d的走菌長度。

1.5不同部位組織分離菌株的生長勢比較試驗

試驗設計、培養基制備與接種培養，方法與1.4相同，除對不同供試菌株生長量測定外，還比較了生長勢。生長勢是根據菌絲萌發的快慢、菌落生長的形態、菌絲生長的密度、色澤和均勻程度，按+++（優：表示菌絲生長整齊、純白、濃密）、++（良：表示菌絲生長不齊、純白、較密）、+（差：表示菌絲生長不齊、淡白、稀疏）三級標準進行直觀評判。

1.6不同部位組織分離菌株的抗逆性比較試驗

1.6.1試驗設計

雙因素試驗，因素1設4個水平，即接種A，B，C，D 4種供試菌株；因素2也設4個水平，即選擇21，24，30，33℃4種菌絲生長不良的溫度條件，恒溫培養菌絲；設置4個重復。劃線法測定菌絲生長量。

1.6.2接種與培養

培養基制備、接種與生長量測定方法與1.4相同，將試管按設計要求分別放入21，24，30，33℃的恒溫培養箱內培養。

1.6.3抗逆性評估

接種塊萌發后繼續恒溫培養，主要根據大杯蕈菌株在各種逆境溫度下的生長量，結合菌絲色澤、濃密程度等生長勢差異，進行綜合評價。

1.7不同部位組織分離菌株的抗污染試驗

1.7.1試驗設計

雙因素試驗，因素1設4個水平，即接種A，B，C，D 4種供試菌株；因素2也設4個水平，即細菌、鏈孢霉、青霉、綠色木霉4種染菌培養基；設置5個重復。劃線法測定菌絲生長量。

1.7.2含雜菌培養基制備

先配制PDA培養基，各取25 mL等量分裝25 mm×200 mm試管內，121℃滅菌30 min，水平放置于水平臺上自然冷卻，無菌操作下棄除前端1 cm的培養基；分別取2 mL細菌、鏈孢霉、青霉和綠色木霉懸濁液注入試管內，搖蕩使其布滿培養基表面，多余倒棄；用預先高壓滅菌備用的無菌棉花塞替換被培養液濕潤的棉花塞，制成含菌PDA試管平面培養基。

1.7.3抗污染能力評估

分別在含菌PDA試管平面培養基上接種大小一致、菌絲密度一致、菌齡一致的A，B，C，D菌株供試接種塊，接種位置事先用記號筆劃線定位，然后置于27℃的恒溫箱中培養3 d，接種塊萌發后繼續恒溫培養，根據大杯蕈菌株在各種含雜菌培養基上的生長速度、菌落大小、菌絲色澤、濃密程度等生長勢和拮抗現象差異，劃分4個不同評分等級，即4分（耐）、3分（較耐）、2分（一般）、1分（差），進行綜合評價［3］。

2　結果與分析

2.1不同組織分離部位的菌絲生長速度比較試驗

不同組織分離部位菌絲的生長量見表1。

表1　不同組織分離部位菌絲的生長量　/cm

不同部位組織分離的菌株菌絲生長量最大的是A菌株，其次是B，C菌株，D菌株最差。

組織分離母種菌絲生長量的方差分析見表2。

表2　組織分離母種菌絲生長量的方差分析

由表2可知，不同部位組織分離的菌株菌絲生長量存在顯著差異。可見，大杯蕈母種組織分離部位的選擇，對菌絲生長起著至關重要的作用。

4種不同部位的差異顯著性（PLSD）法見表3。

由表3可知，A菌株與D菌株存在極顯著差異，與B菌株存在顯著性差異，與C菌株不存在顯著差異；C菌株與B，D菌株存在顯著性差異；B菌株與D菌株間不存在顯著性差異。綜上，A菌株即柄蓋交界處組織分離母種生長量最大。說明在適宜的溫度條件下，傳統組織分離獲得的菌株A表現效果最佳。

表3　4種不同部位的差異顯著性（PLSD）法

2.2不同部位組織分離菌株的生長勢比較試驗

接種后第5天進行生長量、生長勢作比較。

大杯蕈不同部位組織分離母種的結果統計見表4。

表4　大杯蕈不同部位組織分離母種的結果統計

由表4可知，在同批次試管的4個菌株中，以菌柄中上部內部組織分離的母種菌絲萌發較早，生長較快，菌絲生長勢最強；柄蓋交界處組織的生長速度最快，生長勢次之。

2.3不同部位組織分離菌株的抗逆性比較試驗

不同溫度條件下不同組織部位的菌絲生長量見表5，菌株與溫度因素見表6。

表5　不同溫度條件下不同組織部位的菌絲生長量

根據試驗統計結果，進行組織分離母種菌絲生長量的方差分析。

組織分離母種菌絲生長量的方差分析見表7。

表7　組織分離母種菌絲生長量的方差分析

F測驗結果表明，不同菌株間、不同溫度間菌絲生長量都達到極顯著的水平，菌株×溫度的菌絲生長量不存在差異，故需進行多重比較。

2.3.1菌株間和溫度間菌絲生長量差異的顯著性測驗

菌株間和溫度間菌絲生長量差異顯著性測驗見表8。

表8　菌株間和溫度間菌絲生長量差異顯著性測驗

由表8可知，4個組織分離的菌株中B菌株與C，D，A菌株生長量差異均達到極顯著水平；C菌株與A，D菌株生長量差異達到極顯著水平；A菌株與D菌株不存在顯著性差異。B菌株的菌絲生長量最高，C菌株的次之，A菌株的最低。由此可見，A菌株固然在適宜的溫度27℃下生長量最大，但適應的溫度范圍窄；B菌株則對21，24，30，33℃等逆境溫度均有較強的適應能力。

在4個溫度處理中，4個溫度間的菌絲生長量差異均達到極顯著水平，但30℃的菌絲生長量最高，其次是24，21，33℃菌絲生長量最小。由此可見，大杯蕈菌株忍耐逆境高溫的能力要比耐低溫的能力弱，超過最適宜溫度后，生長量下降幅度明顯快于即B菌株對溫度的抗逆性最強，菌株C次之，A菌株與D菌株最差。低于適宜溫度后的下降幅度。

2.3.2不同部位分離的菌株在逆境溫度下生長量差異顯著性測驗

各菌株在逆境溫度下生長量差異顯著性見表9。

綜上所述，B菌株即菌柄中上部內部組織分離母種在4個溫度條件下生長速度最快，生長勢最佳。

表9　各菌株在逆境溫度下生長量差異顯著性

2.4不同部位組織分離菌株的抗污染試驗

正常生長的大杯蕈菌絲純白，氣生菌絲較發達，先端生長整齊。侵染雜菌后，與雜菌接觸部位或受侵染部分，大杯蕈菌絲均發生不同程度的色變，灰黃萎縮，失去原有特征。

2.4.1不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響

綠色木霉侵染后，初期長出灰白色纖細的菌絲，生長緩慢。幾天后，灰白菌落上出現淡綠色粉狀分生孢子，菌落顏色由淡綠色轉變為濃綠色，粉狀層加厚，受污染的菌絲發黃。4個不同部位母種菌絲體在試管中覆蓋綠色木霉菌落，二者不存在拮抗現象，但有逐漸被綠色木霉侵食的趨勢。兩者交界后第3天測其被侵食的平均長度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響見表10。

表10　大杯蕈不同部位組織分離母種與綠色木霉的相互影響

2.4.2不同部位組織分離母種與青霉的相互影響

母種菌絲體受青霉侵染后的癥狀與綠色木霉相似。初期出現白色或黃白色絨狀菌絲，1～2 d菌落便漸漸轉變為綠色粉狀霉層，局限生長。凡有青霉污染的地方，菌絲生長緩慢。4個不同部位母種菌絲在試管中覆蓋青霉菌落，二者不存在拮抗現象，但有逐漸被青霉侵食的趨勢。二者交界后第3天測其被侵食的平均長度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與青霉的相互影響見表11。

表11　大杯蕈不同部位組織分離母種與青霉的相互影響

2.4.3不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響

鏈孢霉侵染后，初期生出呈絨毛狀的菌絲，其菌絲透明，有分枝和分隔且疏松，呈網狀，無色、白色或灰色，生長后期呈粉紅色、黃色。大量分生孢子堆集成團時，外觀與猴頭菌子實體相似。鏈孢霉的侵染能力比其他霉菌強，凡有鏈孢霉污染的地方幾乎不生長。4個不同部位母種菌絲在試管中被鏈孢霉菌落覆蓋，二者不存在拮抗現象，并有逐漸侵食的趨勢。二者交界后第3天測其被侵食的平均長度值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響見表12。

2.4.4不同部位組織分離母種與細菌的相互影響

細菌侵染后，主要是培養基表面覆蓋一層黏液，生長后期并無明顯的其他癥狀。4個不同部位母種菌絲在試管中覆蓋細菌菌苔，繼續生長，二者不存在拮抗現象。經過10 d的觀察，通過劃線法量取生長量，生長量取各試管算術平均值。

大杯蕈不同部位組織分離母種與細菌的相互影響見表13。

2.4.5綜合評價

表12　大杯蕈不同部位組織分離母種與鏈孢霉的相互影響

表13　大杯蕈不同部位組織分離母種與細菌的相互影響

將上述4個不同組織部位母種對4種霉菌抗耐能力的得分分別統計，重復3次取算術平均值。A部位12.3分，B部位14.0分，C部位6.4分，D部位8.0分。以大于12分為好，8～12分為一般，小于7分為差，劃分為3個類別。大于12分，即抗耐性比較好的有A，B部位；8～12分，即抗耐性一般的是D部位；小于7分，即抗耐性比較差的是C部位。結果研究認為，大杯蕈對雜菌是具有一定的抗御能力。

3　結論與討論

（1）綜合上述試驗結果，認為選取成熟前大杯蕈子實體進行組織分離母種所選的4個部位中，B菌株即菌柄中上部內部組織分離母種效果最佳。主要是因為B菌株對21，24，30，33℃等逆境溫度均有較強的適應能力，并且在生長勢和抗污染方面都優于A菌株；而A菌株雖然在適宜的溫度27℃下生長量最大，但適應的溫度范圍窄。由此可見，常規法取菌柄與菌蓋交界處組織并非理想。

（2）在27℃溫度條件下，A菌株菌絲的生長速度雖然快于B菌株，但在生長勢、抗逆性、抗污染方面B菌株均優于A菌株，因此大杯蕈菌種栽培特性的早期評判，是以菌絲生長量為標準好，還是以菌絲生長勢、抗逆性、抗污染等為標準好，是值得深入探討的問題。本研究若有條件進一步進行出菇試驗，將有助于澄清這一問題。

（3）陳明杰等人［5］認為，草菇組織分離物之間和出發菌株之間存在明顯的遺傳差異；王桂芹等人［6］認為，平菇不同部位組織分離物栽培特性的明顯差異是由于低等生物組織細胞的隔膜上有大到足以讓細胞質乃至多種細胞器移動穿過的隔孔，致使不同組織部位的細胞在大小、原生質濃度、細胞器數量、生理活性等方面都存在明顯差異所致。大杯蕈菌柄組織纖維化程度高，細胞小，內含原生質濃度低、細胞器數量少、生理活性差，為何再生的菌絲生長更理想？這種情況在大杯蕈中有無普遍性，其他品種有無類似表現？這些問題均有待進一步研究。

［1］黃年來.中國食用菌百科 ［M］.北京：農業出版社，1993：119.

［2］黃毅.食用菌栽培 ［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1998：217-228.

［3］暴增海，馬桂珍.不同雞腿蘑品種對霉菌抗耐能力的測定與分析 ［J］.中國食用菌，2001（2）：12-13.

［4］郝健，王永紅.平菇組織分離母種優選部位試驗初探 ［J］.延安大學學報（自然科學版），1999（4）：76-79.

［5］陳明杰，余智晟.草菇組織分離物的遺傳變異研究（Ⅱ）［J］.食用菌學報，2000，7（2）：1-4.

［6］王桂芹，王秀艷.平菇子實體不同部位分離母種試驗 ［J］.食用菌，2002，24（1）：15-16.◇

Study on the Best Separates Position of Clitocybe maxima Organization

HUANG Xianzhou1，LIN Xinjian2
（1.Ningde Vocational and Technical College，Fu'an，Fujian 355000，China；2.Soil and Fertilizers Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350003，China）

Test purpose lies in this study is to confirm the best separates position of Clitocybe maxima organization in order to offer artificially of making species.By culture of tissues separated from different four parts of Clitocybe maxima to make mother species，this study explored an experiment that against the bad environment and ability to resist pollution by measuring the growth volume of Clitocybe maxima's mycelium.Through comprehensive comparative analysis，the result indicates in four pieces of different position chosen，mother species separating from the top organization of the stem kind is the best choose.

Clitocybe maxima；separates position of organization；mycelium growth volume；against the bad environment；against pollution

S567.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.028

1671-9646（2016）06b-0005-05

2016-04-17

黃先洲（1982— ），男，碩士，講師，研究方向為茶葉加工、食用菌。