高產D-核糖菌株選育

任柯 張志剛崔鳳霞

（1.鄭州市第十九中學 河南鄭州 450001 2.鄭州拓洋實業有限公司技術中心 河南鄭州 450066）

高產D-核糖菌株選育

任柯1張志剛1崔鳳霞2

（1.鄭州市第十九中學 河南鄭州 450001 2.鄭州拓洋實業有限公司技術中心 河南鄭州 450066）

以枯草芽孢桿菌轉酮醇酶變異株為出發菌株，運用物理和化學相結合的方法進行復合誘變，將出發菌株在紫外燈下照射后加入硫酸二乙酯置于搖床上誘變，再加入硫代硫酸鈉終止反應。選出多個誘變后菌株，進行初篩和復篩，反復幾次，以未經處理的菌株做對照，對突變株進行多次傳代和D-核糖發酵試驗，選育出D-核糖高產突變株。

D-核糖；復合誘變；高產菌株；選育；發酵

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一種五碳糖，是目前合成維生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗腫瘤的藥物[1]。可以轉化為核糖核苷酸和核黃素，應用于制藥、醫藥、化妝品、健康食品以及動物飼料等方面。近年來發現，D-核糖能提高心臟對局部缺血的耐性，改善心肌功能、有效緩解運動后引起的肌肉疼痛，是新興的醫藥保健品，目前在歐美日本等發達國家已經流行，市場需求上升較快。D-核糖還可作為天然的食品甜味劑，所含熱量低且不會引起血糖升高，是肥胖病人、糖尿病人理想的甜味替代品。從未來發展趨勢看，隨著核酸藥物的發展和D-核糖功能作用的認知，D-核糖將作為保健食品被廣泛使用，其市場將在今后較長時期內持續增長。國內外D-核糖生產廠家普遍采用生物發酵法，是以葡萄糖為原料，利用微生物發酵生產，具有成本低、易于大規模生產、環境污染小等優點[2]。D-核糖在我國發酵工業中是一新興的發酵產品，隨著D-核糖產品及其衍生物應用范圍不斷擴展、延伸，新產品的持續開發和市場需求的發展，獲得高產D-核糖的菌種已成為微生物領域研究熱點。國內在D-核糖發酵方面的研究進展迅速，但與國外還有一些差距，存在菌種易退化、發酵產率較低、成本較高等問題。因此，本項目主要研究適合我國發酵企業自身條件和特點的高產D-核糖菌種技術，以達到充分挖掘引進高產菌株的潛力，進一步提高產能，縮短發酵周期，降低生產成本的目的，本文報道了此項研究結果。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）供試菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉酮醇酶（Transketolase）變異株，鄭州拓洋實業有限公司技術中心保存。

（2）儀器：高速冷凍離心機、真空干燥箱、臺式恒溫振蕩器、紫外可見分光光度計、電熱恒溫培養箱、電磁攪拌器、酸度計、100ml帶蓋玻璃瓶（耐冷耐熱）、生物傳感儀、超低溫冰箱、超凈工作臺、高壓滅菌器等。

1.2 培養基

（1）基本培養基（g/L）：葡萄糖 15.0，硫酸銨 2.0，硫酸鎂 0.5，磷酸氫二鉀2.0，磷酸二氫鉀2.0，玉米漿2.0，瓊脂30.0，pH值7.0～7.2。

（2）補充培養基：在基本培養基中添加0.3g/L莽草酸。

（3）完全培養基（g/L）：葡萄糖 15.0，牛肉膏 20.0，蛋白胨 5.0，酵母膏 2.0，瓊脂 30.0，pH 值 7.0～7.2。

（4）種子培養基（g/L）：葡萄糖 20.0，玉米漿 10.0，酵母膏 4.0，蛋白胨10.0，磷酸氫二鉀2.0，磷酸二氫鉀1.0，pH值7.2～7.5。

（5）發酵培養基（g/L）：葡萄糖 90.0，葡萄酸鈣 50.0，玉米漿20.0，硫酸銨 2.0，硫酸錳 0.2，酵母粉 3.0，硫酸鎂 0.4，pH 值 7.2～7.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種誘變處理

將保存的菌種接到完全培養基斜面上，40℃培養30h后，冰箱冷藏30h。將20ml無菌生理鹽水倒人試管內收集菌懸液，轉入250ml三角瓶中，并加入玻璃珠在200r/min的旋轉搖床上振蕩打散細胞，制成單細胞菌懸液冷藏備用。

1.3.2 紫外誘變

取1ml菌懸液用生理鹽水按梯度稀釋法[3]稀釋到10-9數量級，在直徑45mm的培養皿中加入5ml單細胞懸浮液，放入暗箱并用電磁攪拌器進行攪拌，在50W紫外燈下距離15cm照射（紫外燈先預熱30min，使其波長穩定），不同處理時間（60s，90s，120s），黑暗中靜置10h備用。

1.3.3 硫酸二乙酯（D ES）誘變

將5ml經過紫外誘變處理的菌懸液加入到20ml磷酸鹽緩沖液中，再加入1%的DES，40℃置于150r/min的搖床上誘變處理30min，加入硫代硫酸鈉終止反應。

1.3.4 菌株初篩

將在完全培養基上生長，在基本培養基上不生長，卻能在補充培養基上生長的菌落作為初篩對象轉接于裝有完全培養基的試管斜面上，40℃培養60～72h后挑選生長好的作為復篩對象冷藏備用。

1.3.5 菌種定向復篩

對初篩選出的菌株進行搖瓶發酵，多次篩選并測定D-核糖的產量。

1.3.6 菌株產D-核糖的能力試驗

種子培養：種子培養基的裝液量為250ml三角瓶50ml，搖床，40℃培養25h。發酵培養：發酵培養基的裝液量為500ml三角瓶60ml，接種量5%，搖床40℃發酵72h。將誘變后的菌株連續傳代10次后，測定其遺傳穩定性和產D-核糖能力。

1.4 測定方法

菌體OD值測定：將菌液稀釋10倍，紫外可見分光光度計于波長650nm處測定光密度[4]。pH值測定：用pH計測定。D-核糖含量測定：用苔黑酚法測定[5]。

2 結果與分析

2.1 細胞形態變化觀察

在發酵過程中，高產突變株的細胞形態發生變化，前期菌體個體形態小，呈單個細桿狀，分裂末端呈圓形。中、后期菌體形成鏈狀、鎖狀及數字狀，形如霉菌菌絲體，并且菌體形態粗壯，但到發酵結束后，菌體又恢復呈單個桿菌狀。而原出發菌株前期末端呈平頭狀，菌體形態粗短，中、后期成鏈狀，分隔明顯。

2.2 高產菌種遺傳穩定性試驗

經反復多次誘變篩選最終從出發株得到突變株。為了考察高產菌種的遺傳穩定性，將突變菌株連續傳代10次后，測定其遺傳穩定性和產D-核糖能力，結果見表1。

表1 菌種的遺傳穩定性

由表1可知，10代D-核糖產量在109.6g/L，仍維持在較高的發酵水平，平均D-核糖產糖量在110.3g/L，沒有發生顯著變化，說明高產突變菌株具有良好的遺傳穩定性，這是一個穩定的突變株。

2.3 發酵過程的各項指標對照

對供試菌株和高產突變菌株各做了10批發酵實驗，結果見表2。

從表2中兩組數據可以看出，高產突變菌株平均單次D-核糖含量為110.3g/L，平均轉化率66.3%；供試菌株平均單次D-核糖含量為75.1g/L，平均轉化率45.6%，前者比后者分別多出35.2g/L和20.7%，效果是極其顯著的。

表2 變異菌株的發酵產糖量及轉化率

3 結論

供試菌種經紫外和化學誘變處理后，通過選育具有莽草酸缺陷的突變株，獲得了產物積累能力較高的D-核糖生產菌株。與原出發菌株相比，該菌株使發酵液pH穩定在5.5～6.8之間，能使D-核糖單批含量大大提高（平均為110.3g/L），平均提高35.2g/L，增幅達46.90%，發酵轉化率增幅達45.4%。而且該突變株具有穩定的遺傳性，經10代傳種后遺傳性無明顯變化，產量穩定，具有典型的缺失轉酮酶突變株的生長特點，具有很大的生產潛力。

在此，特別感謝輔導老師張志剛的鼎力幫助，謝謝張老師的指導！

[1]邱蔚然，高淑紅.發酵法生產 D-核糖[J].工業微生物，2003，30（1）：58～64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D-ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35（4）：509～517.

[3]范秀容，沈 萍.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1988：102.

[4]任蓓蕾，史小莉，閆世梁，等.D-核糖產生菌抗噬菌體菌株的選育[J].中國新技術新產品，2011，197（07）：14～15.

[5]彭其安，張西峰，吳思方，等.同源重組法構建枯草芽孢桿菌轉酮酶缺失突變菌株[J].生物技術，2006，16（6）：23～16.

張志剛，男，高級教師，從事生物方面的研究。

Q939.99

A

1005-7897（2016）04-0118-02

2016-2-10

任柯（1999-），女，河南鄭州人，高中生，對微生物比較感興趣，根據暑期社會實踐科技創新活動工作整理。