木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護作用實驗研究

鄢榮榜　盧巧巧　賀海波　王心怡　張永峰　覃慧林　汪鋆植

(1. 三峽大學 生物與制藥學院, 湖北 宜昌　443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌　443100; 3. 三峽大學 醫學院, 湖北 宜昌　443002)

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木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護作用實驗研究

鄢榮榜1，2盧巧巧3賀海波1王心怡3張永峰1覃慧林1汪鋆植1

(1. 三峽大學 生物與制藥學院, 湖北 宜昌443002; 2. 湖北航天杜勒制藥有限公司, 湖北 宜昌443100; 3. 三峽大學 醫學院, 湖北 宜昌443002)

摘要：研究了木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保護作用及可能的機制．將昆明小鼠完全隨機分為空白組、模型組、木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)及奧美拉唑(20 mg/kg)組，給藥組小鼠分別灌胃給予相應藥物，每天1次，連續5 d，末次給藥1 h后，除空白組外，各組小鼠分別安10 ml/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 ml 80%乙醇中)，4 h后取胃，延胃大彎剖開，除去胃內容物，觀察胃粘膜外觀形態，并計算胃潰瘍發生率、胃潰瘍指數及胃潰瘍抑制率；刮取胃粘膜，勻漿后，取上清，用試劑盒檢測胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性；取胃粘膜組織，經HE染色后進行組織形態學觀察．木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位能明顯降低胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，改善胃粘膜組織形態，促進潰瘍愈合(P<0.05或P<0.01)．結果表明木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對胃粘膜損傷有較好的保護作用，其作用機制與其抑制胃粘膜COX-2、H+/K+-ATPase活性和增強PGE2活性有關，然而是木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機制目前正在進一步研究中．

關鍵詞：木瓜內生真菌；胃粘膜保護作用；H+/K+-ATPase；COX-2；PGE2

木瓜Chaenomelesspeciosa(sweet)Nakaion為我國傳統的中藥，同時也是民間應用廣泛的食材．具有平肝舒筋、和胃化濕之功效，主要用于風濕痹痛、消化不良和胃腸炎等治療[1]．我們前期研究發現其乙酸乙酯部位和木瓜三萜均具有較好的胃粘膜保護作用[2-4]．本研究擬在此基礎上，從其內生真菌代謝產物來研究其對胃粘膜的保護作用．

1材料與儀器

1.1木瓜內生真菌

木瓜內生真菌分離自資丘木瓜的果皮部分，木瓜樣品采集于湖北省長陽縣榔坪鎮．

1.2培養基

馬鈴薯固體培養基(PDA)：200 g去皮馬鈴薯搗碎后，煎煮30 min，過濾，取濾液分別加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 000 mL，然后在1.25×105Pa壓力下，滅菌20 min，即得．

1.3動物

75只體重為18～22 g的雄性SPF級昆明小鼠(購自三峽大學實驗動物中心)，動物生產許可證：SCXK(鄂)2011-0012．每籠5只，分開飼養，小鼠在動物中心屏障系統適應環境3天后開始進行實驗．

1.4試劑

阿司匹林腸溶片(中國北京拜耳醫藥保健有限公司)；無水乙醇(國藥集團藥業股份有限公司)，H+/K+-ATPase試劑盒(南京建成生物制品研究所)，COX-2 ELISA試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，PGE2 ELISA試劑盒(深圳達科為生物技術有限公司)，其它試劑均為市售分析純．

1.5儀器

電子分析天平(上海天平儀器廠)，Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器(美國奧然科技有限公司)，酶標儀(瑞士Tecan公司)，脫水機(德國Leica公司)，切片機(奧地利Leica公司)，圖像采集系統(德國Leica公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)．

2方法

2.1木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位的制備

將采集的資丘木瓜依次用5%NaClO溶液和75%酒精表面消毒5 min后，取木瓜果皮接種于PDA培養基中，置于28℃恒溫箱中培養．待菌絲長出后，挑取尖端菌絲移至新的PDA培養基上，經幾次純化后得到內生真菌并轉接到試管斜面，進行活化，然后選取活化的菌株，接種到含PDA的固體平板上，當菌落生長到Φ大約6 cm，接種至裝量為200 mL/500 mL的液體PDA培養基三角瓶中，置旋轉式搖床于28℃，120 rpm條件下，培養2～3 d，即得種子液，然后將PDA液體培養基分裝于500 mL三角瓶中，裝液量為200 mL，發酵200瓶，于121℃、1.25×105Pa下滅菌30 min，然后將種子液按5%的接種量接入已滅菌好的PDA液體培養基中，在溫度為28℃，轉速為120轉/分的搖床中培養20 d，發酵液用紗布過濾后，分為上清液和菌絲體．將菌絲體干燥、粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，將提取液和發酵后的上清液合并，減壓濃縮得總浸膏，然后將其依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，得到木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位．使用前用0.5%羧甲基纖維鈉溶液(0.5%CMC-Na)配成相應濃度的混懸液，備用．

2.2實驗分組及胃潰瘍模型的建立

將實驗小鼠按每組15只完全隨機分為空白組、胃潰瘍模型組、木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)和奧美拉唑(20 mg/kg)組，給藥組灌胃給予相應的藥物，空白組和胃潰瘍模型組則給予0.5%CMC-Na溶液，每天1次，連續5 d，末次給藥1 h后，除空白組外，各組小鼠分別安10 mL/kg灌胃給予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 mL 80%乙醇中)，4 h后進行實驗．

2.3檢測指標

2.3.1潰瘍指數的測定

小鼠均頸椎脫臼處死，取胃，肉眼觀察胃黏膜外觀形態．按照我們已發表文章的方法[2]進行潰瘍發生率、潰瘍指數和潰瘍抑制率的分析．

2.3.2胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性測定

完成胃粘膜損傷分析后，用載玻片刮取胃粘膜，稱量后，按1∶49加入0.9%氯化鈉溶液制成勻漿液，離心后，取上清液，按照試劑盒介紹的檢測方法測定H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性．

2.3.3胃粘膜組織形態學觀察

取胃竇部分用多聚甲醛(4%)進行固定后，用梯度乙醇脫水后，石蠟包埋，按片后4 μm進行連續切片，然后進行HE，在顯微鏡下進行形態學分析．

2.4統計學方法

3結果

3.1木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對小鼠胃潰瘍的影響

由圖1可見，空白對照組小鼠胃粘膜呈現淡紅色，粘膜皺襞光滑，未見出血點；模型組可見彌散性出血點，腺胃部粘膜出現充血、水腫及糜爛點；木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位組均可抑制潰瘍形成．經胃潰瘍指數分析，木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)均可顯著減少胃潰瘍指數，而且隨著劑量的增加，其作用效果更為顯著；通過計算分析，木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)對胃潰瘍抑制率分別為32.5%、50.3%、62.4%(見表1)．實驗結果表明木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對乙醇和阿司匹林致小鼠胃潰瘍損傷具有較好的保護作用．

表1　木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對小鼠胃潰瘍的影響±s)

與正常組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01．

3.2木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

由表2可見，模型組胃粘膜組織中H+/K+-ATPase和COX-2活性顯著升高，PGE2活性明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑治療后，上述異常變化均得到了顯著改善(P<0.05，P<0.01)．

表2　木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影響

與正常組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01．

3.3木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對胃粘膜組織形態學的影響

由圖2可見，胃粘膜組織經HE染色后，光鏡下觀察可見，正常組胃粘膜層次清楚，上皮完整，腺體排列整齊，無充血、糜爛現象．模型組胃粘膜可見充血擴張及糜爛性出血，上皮細胞脫落，腺體排列紊亂，并可見炎性細胞浸潤．而木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位和奧美拉唑組胃粘膜未見明顯損傷，少見充血擴張及炎性浸潤．

A.正常組；B.模型組；C.木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位50mg/kg組；D.木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位100mg/kg組；E.奧美拉唑組圖2　木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位對小鼠胃粘膜組織形態學的影響

4討論

近20年來，隨著許多非感染性疾病，如心腦血管疾病、機體衰老等人口的老齡化疾病被相繼證實與機體的炎癥反應密切相關．近年來，學者們發現阿司匹林等非甾體抗炎藥(NSAIDs)可有效降低胃癌、結腸癌等消化道腫瘤的風險和預防心腦血管疾病，使得NSAIDs成為了世界上應用最多的藥品之一，在中國其用量僅次于抗感染藥物[5]．然而隨著其臨床應用范圍的擴大，NSAIDs相關性胃粘膜損傷的病例也越來越多．盡管臨床有鋁/鉍制劑、H2受體拮抗劑、胃泌素受體及質子泵抑制劑可供選用，但往往由于存在療效不持久、停藥后容易復發、副反應等缺點，使其臨床應用受到了極大限制[6-8]．因此，尋找有效防治胃粘膜損傷的措施越來越引起人們的關注．木瓜是常用藥食同源藥材，在民間應用極為廣泛．《本草綱目》記載該藥具有舒筋活絡、和胃化濕之功，可用于腰酸腿痛、風濕性關節炎等疾病的治療．我們前期計算分析和實驗研究發現，其三萜類成分及其中的齊墩果酸在抗炎的同時，顯示出了較好的胃粘膜保護作用[2-4]．根據以上觀點，我們進行了木瓜中內生真菌乙酸乙酯萃取部位對胃粘膜損傷的保護作用研究．實驗結果表明，木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位可顯著降低胃粘膜組織中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃潰瘍發生率、胃潰瘍指數，升高潰瘍抑制率，改善胃粘膜組織形態學，表現出對小鼠胃黏膜損傷良好的保護作用．

現代研究發現胃粘膜有著完善的防御體系，它由粘液-碳酸氫鹽-磷脂屏障、上皮細胞屏障和胃粘膜的微循環三級胃粘膜保護屏障組成．在該體系中，攻擊因子(H+、胃蛋白酶、H+/K+-ATPase、IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2)和防御因子(COX-1、TGF-β、PG、PGE2)維持著動態平衡，當攻擊因子強于防御因子是，胃粘膜表現為胃粘膜損傷[9-10]．防治胃粘膜損傷的根本目的是恢復攻擊因子和防御因子間的動態平衡，恢復胃粘膜防御屏障正常功能．在實驗中，我們發現，胃潰瘍模型小鼠用木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位治療后，胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性明顯降低，PGE2活性顯著降低，且具有明顯劑量依賴性，該結果也與其改善胃粘膜組織形態學實驗結果相一致．

綜上所述，木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位能降低胃粘膜組織中H+/K+- ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃潰瘍發生率、胃潰瘍指數，提高胃潰瘍抑制率及改善胃粘膜組織形態．其保護作用可能與抑制胃粘膜損傷攻擊因子H+/K+-ATPase、COX-2的活性及增強防御因子PGE2活性有關，然而是木瓜內生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何種有效部位/成分起作用及確切的作用機制目前正在進一步研究中．

參考文獻：

[1]江蘇新醫學院．中藥大辭典[M]．上海：上海人民出版社，1997：349-350．

[2]覃慧林，王愛玲，鄧為，等．木瓜乙酸乙酯部位對小鼠急性胃潰瘍的保護作用[J]．中藥藥理與臨床，2015，31(2)：45-49．

[3]汪鋆植，閆喜明，田華詠，等.以土家醫三元論為指導的反選法在新藥研究中的應用[J]．中草藥，2015，46(15)：2189-2192．

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[責任編輯周文凱]

收稿日期：2016-01-04

基金項目：湖北省民間藥物工程研究中心(2015ZY007)；三峽大學生物與制藥學院預研基金(No. Hy1402)

通信作者：賀海波(1972-)，男，副教授，博士，主要從事土家族藥物的活性評價及開發研究．E-mail：hehaibo252219@163.com.

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.021

中圖分類號：R282.71

文獻標識碼：A

文章編號：1672-948X(2016)02-0092-05

Experimental Study of Protective Effect of Gastric Mucosa of Ethyl Acetate Part of Endophytic Fungi fromChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakaion

Yan Rongbang1,2Lu Qiaoqiao3He Haibo1Wang Xinyi3Zhang Yongfeng1Qin Huilin1Wang Junzhi1

(1. College of Biology & Pharmacy, China Three Gorges Univ., Yichang 443000, China; 2. Hubei Aerospace Du Le Pharmaceutical Co., Ltd., Yichang 443100, China; 3. Medical College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractTo investigate the protective effect of gastric mucosa of ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion on gastric ulcer injury in mice, and to explore its possible mechanism, the experimental mice were randomly divided into control, model, ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50 and 100) and omeprazole groups (20mg/kg), 15 mice each group. The gastric ulcers injury were generated by administration of the mixture of ethanol and aspirin which was made up of 10ml 80% ethanol and 15mg aspirin at the 4 hour after drugs on 5th day. The ulcer index, ulcer inhibition rate, histopathological changes, the H+/K+-ATPase, COX-2 and PGE2 activities in gastric mucosa were assessed. The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50,100mg/kg) might remarkably decrease H+/K+-ATPase, COX-2 activities, and increase PGE2 in gastric mucosa, ameliorate ulcer index, ulcer inhibition rate, histomorphology (P<0.05 and P<0.01). The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion possess a good protective effect on gastric mucosa injury in mice, inhibiting the activities of H+/K+-ATPase, COX-2, and enhancing PGE2 activity might be one of its molecular mechanisms; but its chemical composition and detailed active mechanisms of toxicity are under studying.

KeywordsEndophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion;protective effect of gastric mucosa;H+/K+-ATPase;COX-2;PGE2