蒺藜苜蓿E3泛素連接酶U-box基因克隆及表達分析

邵麟惠，鄭興衛，李聰

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

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蒺藜苜蓿E3泛素連接酶U-box基因克隆及表達分析

邵麟惠，鄭興衛，李聰*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

摘要：泛素化在植物生長和發育過程中起重要作用，E3泛素連接酶負責對靶蛋白特異性識別，其中U-box結構的E3泛素連接酶具有調控植物生長發育和免疫反應等功能，并在抗逆性方面發揮作用。目前，關于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未見報道。本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到U-box (MtPUB4)基因，該基因cDNA全長2448 bp，編碼815個氨基酸，包括1個U-box結構(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5個ARM結構域，屬于U-box/ARM類型E3泛素連接酶。構建原核表達載體pET-MtPUB4，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表明在大腸桿菌中表達了MtPUB4蛋白。熒光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表達量最高，在根中表達量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脫落酸誘導，隨著誘導時間增加，表達量呈現出增長趨勢。這些結果表明，MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生長發育和抗逆性中可能起到重要調節作用，但在低溫脅迫中表達量稍微下降，變化不明顯。本研究成功構建了pBI121-MtPUB4植物表達載體，為進一步轉化擬南芥突變體Atpub4奠定了基礎。

關鍵詞：蒺藜苜蓿；E3泛素連接酶；U-box；基因克隆；表達分析

泛素化是真核生物細胞中重要的蛋白質翻譯后修飾的過程，對生物體生長發育和生物體對周圍環境適應性起調控作用，其中泛素分子是由76個高度保守的氨基酸組成的多肽[1]。該過程首先是靶蛋白被泛素分子標記，然后被蛋白酶體識別后降解[2]。標記靶蛋白的過程由E1泛素活化酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶共同介導催化完成[1]。E1泛素活化酶依靠ATP提供能量催化泛素分子與底物蛋白結合，同時激活泛素分子轉移至E2泛素結合酶，最后通過E3泛素連接酶與賴氨酸殘基結合標記靶蛋白[3-5]。E3泛素連接酶在靶蛋白特異性識別中起關鍵作用，依據共價鍵結合方式，可分為HECT (homologous to the E6-AP carboxyl terminus)結構域和RING/U-box結構域[6]。近年來研究表明，E3泛素連接酶參與了各種抗病信號反應途徑的調控，其中U-box蛋白也在抗非生物脅迫和抗病過程中發揮作用[7-8]。

U-box/ARM蛋白是植物中特有的一類蛋白，由70多個氨基酸殘基構成，功能域最初在酵母UFD2蛋白中發現，在多種真核生物中高度保守[9]。植物U-box蛋白的數量多于其他生物，目前在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經鑒定出64個U-box蛋白[10]，水稻(Oryzasativa)中鑒定出77個U-box蛋白[11]，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中鑒定出41個U-box蛋白[12]。研究表明,擬南芥pub4基因影響花粉絨氈層細胞生長發育，在花粉發育的第8～9期開始出現差異變化，其突變體在22 ℃時花粉絨氈層細胞過度生長膨脹或延遲退化、減小了花粉囊腔空間，使花粉粒被擠壓粘連、無法釋放傳粉而造成雄性不育，卻在16 ℃的低溫時可恢復部分育性，說明該基因表達方式對溫度敏感[3]。因此，推測利用此類基因特性可創制出溫敏型雄性不育材料。此外，近年研究人員發現，U-box類基因也參與植物非生物脅迫應答反應，擬南芥AtPUB22和AtPUB23響應干旱脅迫[7]，AtPUB18和AtPUB19基因受NaCl誘導表達[13]，辣椒(Capsicumannuum)基因CaPUB1在擬南芥中超表達可以增強植物的耐鹽性[14]。

蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬草本[15]。二倍體(2n=2x=16)，具有生育期短(80～100 d)、基因組小(454～526 Mb)、自花授粉、易于轉化、再生時間較短等特點,被作為豆科模式植物進行研究，目前已完成全基因組測序[12]。紫花苜蓿(Medicagosativa)與蒺藜苜蓿同屬于苜蓿屬植物，具有相似的遺傳特點，從蒺藜苜蓿中獲得的信息對研究其他豆科植物特別是紫花苜蓿具有重要參考價值。目前，有關蒺藜苜蓿U-box基因家族的研究尚未見報道[12]。因此，本試驗以蒺藜苜蓿為研究材料，利用植物U-box基因序列高度保守的特點，采用RT-PCR方法對蒺藜苜蓿U-box基因編碼區序列進行克隆研究，以期為蒺藜苜蓿U-box基因在花粉發育過程中所起的調控作用和該類基因抗逆特性進行初步探索，為今后通過基因工程手段選育新種質奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1供試植物與試劑

選取蒺藜苜蓿A17基因型，蒺藜苜蓿種子由本實驗室保存。

RNA提取使用TransZolUp Plus RNA Kit(ER501)試劑盒，cDNA反轉錄使用TransScriptII One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix(AH311)試劑盒，PCR擴增使用TransStartFastPfuFly DNA Polymerase酶，實時熒光定量使用TransStartTop Green qPCR SuperMix試劑盒，購于北京全式金生物有限公司。DNA maker DL5000、限制性內切酶BamHI、T4 DNA Ligase連接酶，購于Takara公司；克隆載體使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(CU101)試劑盒、質粒抽提使用EasyPurePlasmid MiniPrep Kit試劑盒，原核表達載體使用pEASY-Blunt Simple cloning Kit試劑盒，膠回收使用 Gel Extraction Kit試劑盒，分別購于北京全式金生物有限公司和北京康為世紀生物有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購于天根生化科技(北京)有限公司；根癌農桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) AGL1由本實驗室保存；pMD18R-T vector載體購于Takara公司。其他試劑為國產分析純級。

1.2實驗方法

1.2.1材料處理將蒺藜苜蓿種子用酒精消毒后播種于鋪有濾紙的培養皿中，在光照培養箱(溫度24 ℃，光照12 h/d)培養至種子發芽，將發芽種子用海綿條包裹種植移至盛有MS營養液的水培盤繼續培養。20 d左右對幼苗開始處理，脅迫處理時將水培溶液換成0.1 mol/L NaCl溶液、20%聚乙二醇(PEG)溶液和 1×10-4mol/L ABA溶液，低溫處理的水培溶液換成蒸餾水置于4 ℃冰箱，分別處理0，2，6，12，24 h，各時間點選取葉片組織置于2 mL離心管，液氮速凍后貯于-80 ℃，提取總RNA，用于 Real-time PCR分析。組織特異性分析選取正常栽培條件下結莢期蒺藜苜蓿根、莖、葉、花、莢果。基因克隆選取開花期16 ℃放置48 h的蒺藜苜蓿葉片。

1.2.2RNA提取及反轉錄取蒺藜苜蓿葉片組織100 mg，按照北京全式金TransZol Plus RNA Kit(ER501)試劑盒說明步驟提取總RNA[16]。利用紫外分光光度計測定RNA含量，經瓊脂糖凝膠電泳檢驗，將質量合格的RNA在-80 ℃條件保存備用。cDNA第一鏈合成方法，反應體系為：RNA 1 μL，5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL, gDNA Removal 1 μL, RNase-free Water 14 μL, 反轉錄反應體系總體積為20 μL，反應條件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，冰浴5 min，-20 ℃條件保存備用。

1.2.3MtPUB4基因全長克隆及生物信息學分析從Genbank中下載MtPUB4基因(登錄號：XP_013460388.1)序列，用Primer Premier 5.0和oligo 5.0軟件設計并合成擴增引物F1/R1(表1)，以反轉錄cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。反應體系50 μL，Template 1 μL，Primer 各1 μL，5×TransStart Buffer 10 μL，dNTPs 5 μL；DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 31 μL；反應條件：預變性 95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，35個循環；延伸72 ℃ 10 min。將PCR擴增產物經凝膠電泳檢測合格后膠回收。將膠回收純化PCR產物，用pMDR18-T載體4 ℃條件下連接過夜；將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，冰浴30 min后，42 ℃熱激30 s，加入LB培養基于37 ℃恒溫搖床振蕩培養過夜后，置于含Amp+抗性的LB平板中進行篩選，對所獲得的單菌落培養后提取質粒、PCR擴增、用BamHI單酶切鑒定，重復24次。對菌液進行PCR檢測，選擇陽性菌液送北京英俊公司進行DNA測序。測定序列用DNAstar軟件進行拼接分析，得到正確的U-box基因核苷酸序列，并進行氨基酸序列預測。

利用NCBI網站(http://ncbi.nlm.nih.gov/)ORF Finder和Conservd Domains程序分析核酸和氨基酸序列；利用在Expasy網站查詢(http://www.expasy.org/tools/)預測蛋白功能；利用Genebank篩選下載其他植物的12種U-box蛋白同源序列，在MEGA 5.0軟件中選擇鄰近結合法(neighbor-joining)構建進化樹，分析MtPUB4編碼的氨基酸序列物種進化關系[16]。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測MtPUB4基因表達量提取總RNA，進行反轉錄合成cDNA第一鏈，方法同1.2.2。使用Bio-Rad CFX96 實時定量PCR儀，采用兩步法進行Real-time PCR擴增。基因特異性引物F3/R3(表1)，內參基因選擇蒺藜苜蓿ACTIN1，引物F2/R2(表1)。反應條件：第一步 94 ℃預變性30 s；第二步 94 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。每個樣品3次重復。根據實驗所得Ct值，利用Livak等[17]報道的fold change=2-ΔΔCT法，計算蒺藜苜蓿MtPUB4基因在根、莖、葉、花、莢果中的表達量。把根的表達量設為對照，莖、葉、花、莢果設為4個處理；不同脅迫處理中，把0 h表達量設為對照，2，6，12，24 h設為4個處理，利用公式進行計算：

ΔΔCT=(CT-gene-CT-actin)脅迫處理-(CT-gene-CT-actin)對照

式中，CT表示循環閾值，CT-gene表示目標基因達到設定閾值的循環數，CT-actin表示Actin基因達到設定閾值的循環數，(CT-gene-CT-actin)脅迫處理表示處理樣品中目標基因經Actin基因校正的循環次數；(CT-gene-CT-actin)對照表示對照樣品中目標基因經Actin基因校正的循環次數；ΔΔCT表示處理樣品中目標基因和對照樣品中目標基因循環次數的差值。然后再計算出2-ΔΔCT的相對表達量，根據計算所得結果繪制柱形圖。

1.2.5蛋白原核表達與鑒定以蒺藜苜蓿cDNA為模板，利用引物F4/R4(表1)，進行PCR擴增。取PCR膠回收產物和表達載體pEASY-Blunt Simple進行連接，將連接產物全部轉化Trans1-T1感受態細胞中，接種SOC(super optimal broth)培養基培養，涂于LB培養基(含50 μg/mL Amp+)37 ℃過夜培養。次日挑取單菌落，以引物F5/R5(表1)進行菌液PCR驗證，將合格菌液加入1 mL含Amp+抗生素的LB培養基37 ℃培養過夜，提取合格質粒送公司測序。以構建好的亞克隆載體為模板，進行PCR擴增目的片段，引物使用F6/R6(表1)，膠回收PCR產物，連接pEASY-Blunt E1載體，轉化Trans1-T1感受態細胞，通過篩選陽性菌液、提取質粒、送交測序，得到插入目的基因重組子pEASY-MtPUB4。

將陽性克隆菌液20 μL接種至2 mL LB(含50 μg/mL的Kan+和Amp+)培養基中37 ℃過夜培養。取30 μL過夜培養菌液，加入至3 mL LB培養基中，37 ℃震蕩培養至OD600約0.6；取部分液體作為未誘導對照組，余下的分別加入0.1，0.2，0.5，1.0 mmol/L的 IPTG誘導劑作為實驗組，在37 ℃震蕩培養。在誘導5 h時取菌體1 mL，離心10000 r/min×30 s 收獲沉淀，用100 μL 1% 磷酸鹽緩沖液PBS (phosphate buffer saline) 重懸，混勻，100 ℃ 10 min。10000 r/min離心10 min，取上清進行SDS-PAGE分析。

1.2.6植物表達載體構建以克隆測序后的質粒為模板，使用TransStartKDPlus DNA Polymerase聚合酶，通過PCR擴增目的片段，以酶切鑒定引物F7/R7(表1)，用內切限制酶BamHI，對克隆載體pMD18-T::Mtpub4進行單酶切。酶切體系共200 μL，質粒120 μL，限制性內切酶4 μL，10×CutSmart Buffer 20 μL，ddH2O補足至200 μL。提取單酶切表達載體質粒，取純化目的基因PCR產物和pBI121載體，用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit (CU101)連接酶連接，將連接體系置于25 ℃連接2 h；連接體系共10 μL，其中載體3.75 μL，目的片段1.25 μL,2×Assembly Mix 5 μL。對于酶切后的表達載體質粒，取純化目的產物，用T4 DNA Ligase連接酶與pBI121載體連接，將連接體系置于25 ℃連接2 h；連接體系10 μL，其中載體3.0 μL，目的片段4 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,5×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL。將質粒連接產物轉化至DH5α感受態細胞，冰浴30 min后，42 ℃ 熱激30 s，加入400 μL LB于37 ℃恒溫搖床振蕩培養，涂于含Kan+抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養；次日挑取單克隆，進行菌落PCR鑒定；取鑒定合格菌液，加2 mL至含Kan+抗性的LB培養基中，37 ℃，200 r/min轉速搖菌過夜，使用EasyPurePlasmid Mini Prep Kit試劑盒提取質粒；將質粒進行酶切鑒定，反應條件為25 ℃ 1 h，37 ℃ 1 h。取鑒定合格菌液，送北京英駿公司測序。

表1　引物信息Table 1　Primers information

2結果與分析

2.1目的基因克隆

取蒺藜苜蓿葉片提取總RNA，凝膠電泳檢測顯示有28S、18S兩個條帶，說明RNA較完整。用紫外分光光度計檢測，A260/A280值為1.877；A260/A230值為2.054，

圖1　蒺藜苜蓿RNA提取和MtPUB4基因PCR擴增Fig.1　RNA extraction and U-box E3 ubiquitin-ligating enzyme gene amplication in M. truncatula　　　A： RNA提取 RNA extraction；B： MtPUB4基因的RT-PCR擴增產物(1～3) Amplification products of MtPUB4 gene by RT-PCR(1-3); M: DNA marker.

說明RNA質量較好(圖1A)。將提取RNA反轉錄合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板，以基因特異性引物進行PCR擴增目的片段(圖1B)，利用DNAMAN拼接后的全長cDNA為2448 bp。將該基因命名為MtPUB4，NCBI登錄號為XP_013460388.1。2.2生物信息學分析

2.2.1保守結構域運用Expasy網站SMART程序對MtPUB4基因編碼的蛋白結構域分析，結果顯示MtPUB4蛋白215～278位氨基酸具有U-box/AEM家族所具備的典型U-box結構，515～764位氨基酸具有典型的ARM重復結構，該基因屬于U-box家族的一員，其編碼的U-box保守氨基酸序列為FCCPLSLELMTDPVIVASGQTYERAFIKNWIDLGLT VCPKTHQTLAHTNLIPNYTVKALIANW。運用NCBI保守域在線分析，該蛋白氨基酸序列C端存在U-box結構域，修飾RING鋅指結構，沒有Zn2+結合配體，蛋白N端存在ARM重復結構，最末端是谷氨酰胺，可能參與E3泛素化。與其他物種U-box蛋白序列多重比對結果表明，U-box/ARM結構區域保守性較強，有127個氨基酸完全一致(圖2)。

2.2.2系統進化將克隆序列提交NCBI網站BLAST程序進行比對，選取同源性較高不同物種序列下載，利用MEGA 5.0軟件鄰近法程序構建系統進化樹[12]。根據圖3顯示結果，克隆序列蒺藜苜蓿MtPUB4與鷹嘴豆(C.arietinum)(XP_0012571337.1)同源性最高，為89%；與野生大豆(G.soja)(KHN48396.1)和大豆(G.max)(XP_003551173.1)、菜豆(P.vulgaris)(XP_007146857.1)同源性次之，都是81%；與其他科屬植物可可(T.cacao)(XP_007047436.1)、木本棉(G.raimondii)(KJB48641.1)、黃瓜(C.sativus)(XP_004149702.1)、煙草(N.tabacum)(AAO61490.1)、甘藍(B.oleracea)(XP_013605017.1)、擬南芥(A.thaliana)(NP_179895.6)和水稻(O.sativa)(AAT94161.1)等植物同源性較低，分別是71%，69%，65%，58%，56%，56%和54%。

2.3蒺藜苜蓿MtPUB4基因組織特異性表達

蒺藜苜蓿MtPUB4基因在不同組織中的相對表達量見圖4。結果表明，MtPUB4在花中表達量最多，其次是葉，根中表達量最少。以蒺藜苜蓿根中MtPUB4基因表達量為對照，花中表達量是根中表達量的26.68倍，葉中表達量是根中15.45倍，莢果中表達量是根中的5.60倍，莖中表達量是根中的4.82倍。

2.4蒺藜苜蓿MtPUB4基因在非生物脅迫下的表達量

蒺藜苜蓿MtPUB4基因分別受到NaCl、PEG、ABA和低溫誘導0，2，6，12，24 h的相對表達量見圖5。結果顯示，MtPUB4基因在NaCl脅迫誘導下，6 h時迅速上升，是2 h時表達量的3倍，12 h時達到峰值，24 h下降(圖5A)。在PEG脅迫誘導下2 h以內變化較小，6 h表達量增到2 h的4倍，達到峰值，與NaCl脅迫下變化近似，但是12 h時開始下降，24 h時表達量低于0 h時表達量(圖5B)。在低溫處理后，2 h時表達量稍微有所下降，6 h時表達量與2 h表達量接近，12 h時持續下降，24 h時恢復至6 h水平(圖5C)。在ABA誘導12 h后，表達量稍有降低，隨后迅速上升，24 h時表達量接近0 h的5倍(圖5D)。除了低溫脅迫MtPUB4基因表達量變化稍有降低，表達量變化不明顯外，其余3種處理方式表達量都出現數倍上升，這說明MtPUB4基因對鹽、干旱和ABA脅迫響應，可能參與這些逆境的信號調控。

2.5MtPUB4基因蛋白原核表達

將目的片段連接pEASY-Blunt Simple載體，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，經測序驗證序列正確，表明蛋白表達載體構建成功。將含有陽性質粒的大腸桿菌表達菌BL21(DE3)pLysS Chemically Competent Cell株系，用不同濃度的IPTG誘導表達，上樣濃度為0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L。結果顯示，含有MtPUB4片段的表達載體菌體在誘導后出現特異性條帶，各個濃度對蛋白表達影響不明顯。該蛋白在90 kDa條帶處，與預期結果88.36 kDa相符(圖6)。說明該蛋白在大腸桿菌中成功誘導，可用于進一步蛋白表達研究。

圖2　MtPUB4與其他植物U-box蛋白氨基酸保守區序列多重對比分析Fig.2　Multiple alignment analysis of MtPUB4 conserved domain with its homologous in other plants

續圖2　MtPUB4與其他植物U-box蛋白氨基酸保守區序列多重對比分析Continued Fig.2　Multiple alignment analysis of MtPUB4 conserved domain with its homologous in other plants　Cicer arietinum:鷹嘴豆；Glycine soja:野大豆；Glycine max:大豆；Phaseolus vulgaris:菜豆；Theobroma cacao:可可；Gossypium arboreum:木本棉；Cucumis sativus:黃瓜；Nicotiana tabacum:煙草；Brassica oleracea:甘藍；Arabidopsis thaliana:擬南芥；Oryza sativa:水稻。Consensus 表示序列一致性，黑色表示100%相同，粉色表示75%相同，藍色表示50%相同。Consensus indicates same sequences and are listed below；Black indicates 100% identity；Pink indicates 75% identity；Blue indicates 50% identity.

圖3　蒺藜苜蓿U-box E3泛素蛋白MtPUB4進化樹分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of U-box E3 ubiquitin-ligating enzyme MtPUB4 proteins in M. truncatula

圖4　MtPUB4基因在蒺藜苜蓿不同組織中的相對表達量Fig.4　The relative expression of MtPUB4 gene in different tissues of M. truncatula

2.6植物表達載體構建

將植物表達載體pBI121和克隆載體分別酶切，回收相應片段純化連接、轉化、挑取單菌落、提取質粒，構建MtPUB4基因植物表達載體。經過BamHI酶切鑒定，得到與預期大小一致的目的片段(圖7)。鑒定為陽性的質粒送公司測序后拼接，與基因序列一致，說明成功構建植物表達pBI121-MtPUB4。

圖5　MtPUB4基因在NaCl、PEG、4 ℃低溫和ABA處理后的相對表達量Fig. 5　The relative expression of MtPUB4 gene treated by NaCl, PEG, ABA and 4 ℃　A: NaCl 處理 NaCl treatment; B: PEG處理 PEG treatment ; C: 4 ℃ 低溫處理 4 ℃ treatment; D:脫落酸處理 ABA(abscisic acid) treatment

圖6　MtPUB4融合蛋白SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色Fig.6　Coomassie-stained SDS-PAGE gel illustrating MtPUB4 His-tag fusion protein expression in E. coli

圖7　植物表達載體PCR和酶切驗證Fig.7　Identification of expression vector by enzyme digestion

1～5 ：0，0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導的菌體蛋白。 1-5 indicate 0，0.1，0.2，0.5 and 1.0 mmol/L IPTG induction bacterial protein；M：蛋白標記 Protein marker.1～2：表達載體pBI121質粒提取結果。1-2: Results of vector pBI121 plasmid extraction; 3～4：質粒單酶切后結果。3-4: Results of single enzyme digestion; M：DL5000 DNA marker.

3討論

U-box E3泛素連接酶基因在植物生長發育和抗逆過程中起著重要作用。目前E3 泛素連接酶U-box的研究主要集中在擬南芥、水稻、煙草等模式植物中。本研究得到的蒺藜苜蓿MtPUB4基因的氨基酸序列中(圖3)，在C端存在Ring super family U-box結構域，有Zn指結構40個殘基結合2個Zn原子，由半胱氨酸和組氨酸組成，可能參與蛋白質與蛋白質之間的相互反應，Hatakeyama等[8]認為這類蛋白與序列復制、信號傳導和發育有關；在N端有連續5個ARM重復結構，末端是谷氨酰胺，推測參與E3泛素化。有學者認為ARM結構域蛋白質在植物生長發育和激素應答等方面起重要作用[9,18]。在某些植物U-box蛋白中，如擬南芥中ARC1(Arm Repeat Containing 1)，其C端含有一個6～7個ARM重復結構功能域，中間含有一個U-box功能域，是SRK激酶下游信號的傳遞因子，能在柱頭乳突細胞中特異性表達，能促進花粉水合、萌發和花粉管生長的雌性親和因子[19]。在水稻中發現的SPL11[20-22]、煙草中的ACER276[23]、擬南芥中的AtPUB17等U-box基因都與植物抗病性有關[24]；馬鈴薯(Solanumtuberosum)中發現的U-box基因PHOR1(photoperiod-responsive1)參與GA信號轉導，是GA信號轉導途徑中的正調控因子[25]；煙草中的NtPUB4參與了植物發育和細胞分裂素信號轉導[26]；擬南芥AtPUB4的U-box/ARM功能域缺失能使絨氈層結構肥大最終導致植物雄性不育[3]；蒺藜苜蓿中未見報道。通過構建系統進化樹結果表明，它們與同科屬植物同源性很高，和其他科屬的植物同源性較低，這與其他學者在其他物種間同源性分析結論基本一致[16,27]，說明同源關系較近的植物中基因保守性更強。依據屬內同源性較高的理論，說明U-box/ARM蛋白家族基因進化上也比較保守，其氨基酸序列相似度可在一定程度上說明了不同物種親緣關系遠近，本研究中的蒺藜苜蓿MtPUB4基因與擬南芥AtPUB4基因、煙草NtPUB4的同源性較低，但是在同一類型進化枝上，這可能與擬南芥與煙草基因組較小有關系。

前人研究表明U-box E3連接酶可調控植物多個生理代謝途徑，Samuel等[28]研究發現，擬南芥中的U-box/ARM蛋白家族與擬南芥SD1受體蛋白激酶亞家族相互結合，通過酵母雙雜交實驗表明，兩個受體結合可使U-box/ARM蛋白的ARM功能域磷酸化，從而參與調控植物生理過程。Kim等[26]研究認為，煙草的NtPUB4參與CHRK1介導的植物發育及細胞分裂素信號轉導過程。據報道，CHRK1是煙草內的一種新型類受體激酶，參與調控發育信號轉導及內源細胞分裂素平衡，且NtPUB4在煙草的花器官大量表達，在苗、根、莖、葉中少量表達。本研究中，蒺藜苜蓿Mtpub4基因也在花中大量表達，與NtPUB4、ARC1有相似的結構域，因此推測它們具有相似的功能。而CHRK1與SRK類受體激酶聚類在一起，推測NtPUB4與ARC1功能相似[26]。Samuel等[28]在擬南芥中研究發現，一些U-box/ARM基因受到NaCl脅迫誘導表達，基因表達量會上調。以上結果表明U-box基因在抗性方面也可能發揮作用。本實驗增加了干旱、低溫和ABA誘導方面的研究，通過模擬各種脅迫條件，MtPUB4基因在受到NaCl、PEG和ABA脅迫誘導后，基因表達量都數倍提高，此基因在NaCl、PEG和ABA脅迫反應中也可能參與調控反應，但在低溫脅迫中，表達量稍微下降，變化不明顯。

雄性不育與一些基因突變有關，產生這些基因突變的主要原因包括光周期、光強度、濕度和溫度等環境因素的改變。目前，利用這種現象人工篩選突變體，通過兩系配套法培育不育系已在雜交作物的生產上成功應用[29]。在擬南芥中，突變體Atpub4在16 ℃中可恢復部分育性，主要是花粉囊中的花粉粒可成功授粉。目前尚無蒺藜苜蓿U-box E3泛素連接酶蛋白的相關研究[30]，我們通過全基因組U-box結構域分析得出，蒺藜苜蓿MtPUB32可能與ARK2共同調控植株側根發育，MtPUB26可能與干旱脅迫相關[12]。通過對克隆蒺藜苜蓿MtPUB4序列分析，得出它與擬南芥AtPUB4蛋白間有共同保守域結構，利用生物信息學相關軟件分析基因序列特征、功能蛋白結構、基因進化關系，發現克隆基因屬于植物U-box家族成員，具備1個U-box結構域和5個ARM重復結構。本研究為進一步了解U-box基因如何調控蒺藜苜蓿的生長發育，以及如何參與逆境脅迫信號轉導，揭示植物生長發育過程中的一些機制提供理論基礎。

4結論

本實驗通過RT-PCR技術，克隆了蒺藜苜蓿U-box E3泛素連接酶基因，對其核苷酸、氨基酸序列對比分析，檢測相對表達量變化規律，進行原核表達并提取了MtPUB4蛋白，同時成功構建植物表達載體。為后期篩選蒺藜苜蓿雄性不育基因、將其轉化至擬南芥Atpub4雄性不育突變體材料進行遺傳互補提供了候選基因。

References：

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DOI：10.11686/cyxb2016073

*收稿日期：2016-03-02；改回日期：2016-04-01

基金項目：國家自然科學基金(31372362)項目和“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD17B01)資助。

作者簡介：邵麟惠(1981-)，女，甘肅合水人，在讀博士。E-mail:shaolinhui@126.com *通信作者Corresponding author. E-mail:licong0520@sina.com

* 1Cloning and expression analysis of a U-box gene of E3 ubiquitin ligase fromMedicagotruncatula

SHAO Lin-Hui, ZHENG Xing-Wei, LI Cong*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Abstract:The E3 ubiquitin ligase is essential for the specific recognition of target proteins of ubiquitin, and therefore, it plays an important role in plant growth and development. The U-box family of E3 ubiquitin ligases function in regulating plant immune responses and stress resistance. To the best of our knowledge, there have been no reports on U-box family genes in Medicago truncatula. In this study, a U-box gene (MtPUB4), consisting of a 2448-bp cDNA encoding a putative protein of 815 amino acids, was cloned from M. truncatula. A sequence alignment analysis revealed that the MtPUB4 protein contains a U-box domain (C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H) and two ARM (Armadillo) regions. Therefore, it was classified as a U-box/ARM E3 ubiquitin-ligase. We constructed a prokaryotic expression vector (pET-MtPUB4), and an SDS-PAGE analysis confirmed that the MtPUB4 protein was successfully expressed in prokaryotic cells. Real-time polymerase chain reaction analyses showed that the transcript levels of MtPUB4 were higher in flowers and lower in roots. Abiotic stresses such as NaCl, polyethylene glycol, and abscisic acid resulted in increased transcript levels of MtPUB4, with higher transcript levels after longer induction times. The transcript levels of MtPUB4 decreased slightly under low-temperature stress. These results indicated that MtPUB4 may be involved in regulating growth, development, and stress resistance in M. truncatula. The construction of the pBI121-MtPUB4 vector has laid the foundation for transformation of Arabidopsis in future studies.

Key words:Medicago truncatula; E3 ubiquitin-ligase enzyme; U-box; gene cloning; expressing analysis

http://cyxb.lzu.edu.cn

邵麟惠， 鄭興衛， 李聰. 蒺藜苜蓿E3泛素連接酶U-box基因克隆及表達分析. 草業學報, 2016, 25(7): 62-72.

SHAO Lin-Hui, ZHENG Xing-Wei, LI Cong. Cloning and expression analysis of a U-box gene of E3 ubiquitin ligase fromMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(7): 62-72.