針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠扭體反應和血管舒縮物質的影響

王洋,羅麗,李曉泓,趙鵬飛,章慶慶,朱世鵬,張玲,申松希,齊丹丹,楊佳敏,沈小雨,郭孟瑋,趙雅芳,嵇波,任曉暄,張露芬,朱江,李凱歌,譚莉華(.北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 0009;.瀘州醫學院附屬醫院,瀘州 646000;3.北京中醫藥大學,北京 0009;4.中國中醫科學院廣安門醫院,北京 0003;.南京中醫藥大學第二臨床醫學院,南京 0046)

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針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠扭體反應和血管舒縮物質的影響

王洋1,羅麗2,李曉泓1,趙鵬飛3,4,章慶慶1,朱世鵬5,張玲1,申松希1,齊丹丹1,楊佳敏1,沈小雨1,郭孟瑋1,趙雅芳1,嵇波1,任曉暄1,張露芬1,朱江1,李凱歌1,譚莉華1
(1.北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 100029;2.瀘州醫學院附屬醫院,瀘州 646000;3.北京中醫藥大學,北京 100029;4.中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053;5.南京中醫藥大學第二臨床醫學院,南京 210046)

【摘要】目的觀察針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠鎮痛效應及血管舒縮物質的影響。方法本實驗用注射苯甲酸雌二醇和縮宮素再結合全身冷凍的方法制備寒凝證類痛經大鼠模型,觀測大鼠扭體反應(扭體潛伏期、扭體次數、扭體評分),并用酶聯免疫吸附法測定血漿TXB2和6-keto-PGF1a含量。結果與鹽水組比較,模型組扭體潛伏期明顯縮短,扭體次數明顯增多,扭體評分明顯升高(P＜0.01);與寒凝證類痛經模型組比較,針刺組扭體潛伏期均明顯延長,扭體次數均明顯減少,扭體評分均明顯降低(P＜0.05,P＜0.01)。與鹽水組比較,模型組血漿6-keto-PGF1a含量明顯降低(P＜0.05);血漿TXB2含量有上升趨勢(P ＞0.05)。與模型組比較,針刺(關元)組血漿6-keto-PGF1a含量有升高趨勢(P＞0.05);血漿TXB2含量有降低趨勢(P＞0.05)。結論寒凝證類痛經大鼠血液中血管舒縮物質出現明顯紊亂。針刺關元穴可在改善痛經大鼠扭體反應緩解痛經程度的同時,良性調節TXB2及6-keto-PGF1a。血管舒縮物質可能是針刺防治痛經的重要物質之一。

【關鍵詞】針刺;穴,關元;寒凝證;痛經;扭體反應;血管舒縮物質;大鼠

中醫學理論認為痛經的核心病機是胞宮“瘀”阻,其中寒凝“瘀”阻占據比例較高,針灸具有活血化瘀作用,治療痛經有良效。大量研究已發現,“瘀”阻與血管舒縮物質密切相關[1]。雖然我們前期的研究已證明針刺對寒凝證類痛經的防治作用[2],但確切的機制尚不完全清楚。本研究試圖從血管舒縮物質的角度,探尋寒凝造成胞宮“瘀”阻痛經狀態下大鼠子宮的痛經程度及針刺關元穴對其的影響,揭示針刺對寒凝證類痛經鎮痛效應的部分機制,以期為寒凝型痛經的針刺治療提供新的實驗依據。

1　材料與方法

1.1動物與分組

采用清潔級SD大鼠,雌性,鼠齡3個月,體重(240 ±20)g,性成熟未交配,由北京軍事醫學科學研究院提供,合格證號為SCXK2007-004(軍)。飼養條件為室內溫度(23±1)℃,濕度(45±5)%,日光燈光照,普通清潔級鼠飼料,自由飲用自來水。

在飼養過程中,通過陰道涂片[3]法,每日定時用細棉簽蘸以生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm,稍微轉動后取出,將帶有陰道內容物的細棉簽在載玻片上均勻轉動涂片,在空氣中干燥。美蘭染色10 min,用清水將美蘭輕輕沖掉,然后在顯微鏡下觀察陰道涂片的組織學變化,根據細胞形態、種類及數量篩選出處于動情間期的3月齡SD雌性大鼠24只,采用隨機數字表法將大鼠分為鹽水對照組(簡稱鹽水組)、寒凝證類痛經模型組(簡稱模型組)、針刺組,每組8只。

1.2主要試劑和儀器

儀器包括TX51顯微鏡(日本Olympus公司);H8-202顯微鏡(日本尼康);BC/BD-379HB臥式冰柜(青島海爾集團);BT223S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);MDF-u50A型超低溫冰箱(日本三洋公司);5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);針灸針(規格0.25 mm×40 mm,北京中研太和醫療器械有限公司);秒表。

試劑包括苯甲酸雌二醇注射液(寧波市三生藥業有限公司,批號120207);縮宮素注射液(上海禾豐制藥廠生產,批號120302);自制美蘭染色溶液。

1.3寒凝證類痛經模型制備

首先用陰道涂片法篩選出處于動情間期的3月齡SD雌性大鼠,依據《藥理實驗方法學》[4]并加以改進,采用較公認的苯甲酸雌二醇和縮宮素聯合制備法制備類痛經大鼠模型,再結合全身冷凍法制備寒凝證類痛經大鼠模型。模型組、針刺關元組采用全身冷凍法結合苯甲酸雌二醇注射法造模,每日給予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續10 d,第1天及第10天日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次給藥后1 h后,腹腔注射縮宮素2 U/只,第1～5天每日在給藥后放入﹣25℃冰柜冷凍4 h,中途在2 h打開冰柜換氣5 s。鹽水組每日注射同等劑量的生理鹽水。降低 (P＜0.05);血漿TXB2含量無明顯變化 (P＞0.05)。與模型組比較,針刺關元組血漿6-keto-PGF1a和TXB2含量均無明顯變化 (P＞0.05)。詳見表2。

1.4處理方法

第10天注射縮宮素模型制備成功后,針刺組給予相應的針刺處理,模型組和鹽水組不做處理,觀察各組大鼠的扭體反應情況20 min。

1.5針刺方法

關元穴位于大鼠兩后肢根部連線的中點[5]。針刺深度4～5 mm,在刺入即刻和留針10 min時分別施平補平瀉手法30 s,留針20 min,再緩慢平和地將針退出。

1.6取材及檢測

1.6.1大鼠扭體反應

采用Schmauss提出的行為學評分標準[6],將扭體行為分為0～3四個等級,0級為正常姿勢(手爪平放盒底或正常探查行為);1級為身體斜向一邊;2級為后肢伸展,后爪背屈,軀體伸展伴頻繁的盆骨側向旋轉;3級為腹部肌肉收縮,后肢后伸。記錄20 min內扭體反應的潛伏期和扭體評分。扭體潛伏期為注射縮宮素后至出現扭體反應的時間(min);扭體評分=0級(次數) ×0分＋1級(次數)×1分＋2級(次數)×2分＋3級(次數)×3分。

1.6.2血漿TXB2及6-keto-PGF1a含量

大鼠在觀察扭體反應后,即刻快速去冠取血,每只取3 ml置于肝素抗凝管(30mL EDTA,40mL抑肽酶)中,待血液靜置30 min后用低溫離心機在4℃、3500 r/min條件下離心15 min,取血漿,﹣20℃保存備測。采用ELISA方法檢測血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量,由寰宇金科生物醫學技術有限公司完成。

1.7統計學方法

應用SPSS17.0軟件進行統計處理。計量數據以均值±標準差表示。多組間比較采用方差分析(ANOVA),兩兩比較用LSD-t檢驗,以P＜0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1扭體反應比較

與鹽水組比較,模型組扭體潛伏期明顯縮短,扭體次數明顯增多,扭體評分明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,針刺組扭體潛伏期明顯延長,扭體次數減少,扭體評分降低(P＜0.05,P＜0.01)。結果見表1。

2.2針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響

與鹽水組比較,模型組血漿6-keto-PGF1a含量明顯

表1　針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠扭體行為的影響

表1　針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠扭體行為的影響

注:與鹽水組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別　n　　潛伏期(min)　扭體次數(次)　　扭體總分(分)鹽水組　8　2.63±1.19　6.13±4.39　7.13±5.94模型組　8　0.13±0.351)　25.88±4.521)　45.75±14.781)針刺組　8　1.50±1.282)　11.25±4.233)　18.25±9.713)

表2　針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響

表2　針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠血漿6-keto-PGF1a、TXB2含量的影響　

注:與鹽水組比較1)P＜0.05

組別　n　6-keto-PGF1a　TXB2鹽水組　8　25.29±2.94　101.82±27.75模型組　8　19.28±3.071)　122.78±22.54針刺組　8　21.73±3.26　98.82±27.24

3　討論

PGI2和TXA2均是花生四烯酸的代謝產物。PGI2是迄今活性最強的血小板聚集內源性抑制劑[7],可通過抑制血小板堆積及強烈的舒張平滑肌的擴張血管作用。TXA2主要由血小板線粒體合成和釋放,有促進血小板聚集并且誘發血栓形成的作用。在生理狀態下,PGI2和TXA2作用相反,二者的含量維持在正常水平從而保證血管壓力以及血液循環暢通,在循環系統中發揮著重要的作用。而子宮體內含有豐富的血管,子宮血管平滑肌的舒縮功能有賴于PGI2和TXA2二者含量的穩定。

感受寒冷刺激,使血管內皮細胞分泌縮血管物質(TXA2)和舒血管物質(PGI2)含量異常,子宮血管平滑肌劇烈收縮,子宮血管痙攣,導致局部組織缺血、缺氧、炎癥;血小板聚集,使血液處于高凝狀態,出現寒凝證痛經中“凝”,是寒凝證痛經的主要原因之一[8]。

本實驗采用苯甲酸雌二醇聯合縮宮素造類痛經模型,再結合全身冷凍法,制造寒凝證類痛經模型[9-11]。雌激素可以使非妊娠大鼠子宮肌層縮宮素受體含量提高[12-13],腹腔注射縮宮素后,縮宮素與子宮肌層的縮宮素受體結合,可以引起子宮平滑肌劇烈收縮,而平滑肌收縮也符合中醫學“寒性收引”的特點,最終“不通則痛”導致痛經的發生,表現為大鼠的扭體反應加強[14]以及PGI2和TXA2含量的異常。而PGI2、TXA2半衰期很短,故實驗中常測定其穩定產物6-keto-PGF1a和TXB2以反映PGI2和TXA2的水平[15]。扭體反應是目前應用最廣的內臟痛模型之一,長期以來一直用來檢測中樞及外周的鎮痛效應[16],在痛經的防治和機理研究中運用較多。

我們的研究結果顯示,針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠疼痛反應、TXB2與6-keto-PGF1a的含量均有一定影響。針刺關元穴能較迅捷地緩解寒凝證痛經的扭體反應,緩解痛經程度。針刺關元穴鎮痛效應與其改善造模后寒冷和疼痛的雙重刺激使全身尤其是子宮血管內皮細胞損傷,血管舒張和收縮物質含量異常有關。針刺關元穴對寒凝證類痛經大鼠血漿TXB2與6-keto-PGF1a含量存在一定程度的良性調節作用,表現為增加6-keto-PGF1a合成,同時使血小板內TXB2合成減少,而抑制血小板聚集,恢復6-keto-PGF1a和TXB2正常含量,從而改善血管瘀滯及痙攣狀態而緩解疼痛。

本研究結果表明,針刺關元穴能緩解寒凝證痛經的疼痛反應,并改善TXB2和6-keto-PGF1a的水平。針刺可能通過增加PGI2合成、抑制TXA2合成,從而抑制血小板聚集、減少血管收縮痙攣而治療痛經,體現了針刺活血祛瘀的治療作用。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.06.0636

文章編號:1005-0957(2016)06-0636-03

收稿日期2015-12-20

基金項目:國家重點基礎研究發展計劃項目(2012CB518506,2006CB504 503,2005CB523308);國家自然科學基金面上項目(3097379 3);教育部博士點基金項目(20090013110005)

作者簡介:王洋(1989-),男,2013級碩士生

通信作者:李曉泓(1960-),女,教授,博士,博士生導師,研究方向為針灸與治未病,Email:xiaohong_li@sina.com

Effect of Acupuncture at Guanyuan(CV4)on Writhing Response and Vasomotor Substances in Rats with Dysmenorrhea Due to Coagulated Cold Syndrome

WANG Yang1,LUO Li2,LI Xiao-hong1,ZHAO Peng-fei3,4,ZHANG Qing-qing1,ZHU Shi-peng5, ZHANG Ling1,SHEN Song-xi1,QI Dan-dan1,YANG Jia-min1,SHEN Xiao-yu1,GUO Meng-wei1,ZHAO Ya-fang1,JI Bo1,REN Xiao-xuan1,ZHANG Lu-fen1,ZHU Jiang1,LI Kai-ge1,TAN Li-hua1.
1.School of Acupuncture-moxibustion and Tuina,Beijing UniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou 646000,China;3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;4.Guang’anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China;5.Second School of Clinical Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

[Abstract]ObjectiveTo observe the analgesic effect of acupuncture at Guanyuan(CV4)and its effect on vasomotor substances in rats with dysmenorrhea due to coagulated cold syndrome.MethodThe coagulated-cold dysmenorrhea rat model was developed by Estrodiol benzoate and Oxytocin injectin plus physical freezing.The writhing response(writhing latency,writhing frequency,and writhing score)was observed,and the contents of TXB2and 6-keto-PGF1awere detected by using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultCompared with the saline water group,the writhing latency was significantly shortened,the writhing frequency was significantly increased,and the writhing score was more significantly increased in the model group(P＜0.01); compared with the model group,the writhing latency was significantly prolonged,the writhing frequency was decreased,and the writhing score was significantly lower in the acupuncture group(P＜0.05,P＜0.01).Compared with saline water group,the content of plasma 6-keto-PGF1awas significantly lower(P＜0.05)and the content of plasma TXB2showed an increasing tendency(P＞0.05) in the model group.Compared with the model group,the content of plasma 6-keto-PGF1ashowed an increasing tendency(P＞0.05) and the content of plasma TXB2showed a decreasing tendency(P＞0.05)in the acupuncture group.ConclusionThe vasomotor substances are obviously disordered in the blood of cold-coagulated dysmenorrhea rat models.Acupuncture at Guanyuan can improve the writhing response and release pain,and meanwhile positively regulate the vasomotor substances such as TXB2and 6-keto-PGF1a.The vasomotor substances are plausibly one of the major substances in the action of acupuncture in preventing and treating dysmenorrhea.

[Key words]Acupuncture;Point,Guanyuan(CV4);Coagulated cold syndrome;Dysmenorrhea;Writhing response;Vasomotor substance;Rats