超聲波輔助酒精發酵技術

王振斌，劉鳳葉，馬海樂，王　林，張存勝，閆景坤，劉加友

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

超聲波輔助酒精發酵技術

王振斌，劉鳳葉，馬海樂，王林，張存勝，閆景坤，劉加友

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

摘要：為了促進釀酒工藝的發展，探討超聲波促進酵母酒精發酵的機理，在對超聲波處理前后的酵母菌數量、發酵液殘糖量、酒精產生量和發酵液黏度研究的基礎上，利用掃描電鏡和核磁共振技術對超聲波處理前后的酵母菌表征和水分子團簇進行了研究。研究結果表明，對照組酵母菌落數和酒精含量分別在42 h和90 h達到最大值2.65×108cfu/mL和4.5 g/L，發酵液黏度逐漸降低，酵母細胞表面形體飽滿，無大的凹陷，發酵末期水分子團17O半峰寬為85.39 Hz。超聲組相比對照組菌落總數提前18 h達到最大值2.75×108cfu/mL，還原糖消耗速率和酒精產生速率顯著加快，發酵液黏度明顯低于對照組，酵母細胞形體表面粗糙，出現一定程度的凹陷，發酵末期水分子團17O半峰寬為54.32 Hz。本研究為超聲波處理技術在生物發酵工藝方面的應用提供了理論依據。

關鍵詞：酒精發酵； 超聲波處理； 發酵速度； 機理

酒文化源遠流長，酒類飲品在我們的生活中扮演著非常重要的角色，需要貯存一定的時間，才能很好地提升品質。現在釀酒工藝日漸成熟，發酵法釀造乙醇有悠久的歷史，但傳統工藝生產效率低、成本過高［1］，已難以滿足現代生物發酵工程的需要，迫使人們不斷利用相關學科最新的科研成果來改進發酵工藝?，F在應用比較多的有一些化學方法［2-4］。迄今，一些物理量如光、電、熱、電磁等對發酵過程生物學特性（如酶的活性等）的影響，人們已進行了一定的研究且取得了不少成果。

近年來，由于超聲波處理設備的普及和發展，超聲波對發酵過程的影響正引起研究者強烈的興趣和高度的重視，目前已廣泛應用于電子、機械、輕工等行業［6-7］。近年來在生物領域的應用愈來愈受到重視［8］，合適強度的超聲波作用于發酵液，可改善生物反應條件［9］。在超聲波作用下，超聲空化，機械作用改變了膜上脂雙分子層結構而使微生物細胞膜電位發生改變，激活Ca+、K+等離子通道，膜兩側物質滲透速度即膜的通透性增加，促進對底物的利用和體內代謝物的轉移，進而促進了細胞的生長并縮短細胞生長的遲滯時間［10-11］。低強度超聲波加載于微生物發酵過程中，可以加速微生物細胞的生長，同時可以促進有益代謝產物的合成。

本研究將超聲波技術應用在鎮江香醋的傳統釀造的酒精發酵過程中，以低強度超聲波提高發酵效率、縮短發酵時間，并從不同方面進一步的了解促進的機理，為鎮江香醋釀造技術的發展提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

菌種：釀酒酵母。

種子培養基：YEPD培養基，115℃滅菌30 min。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖50 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，CaC120.06 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，于115℃下滅菌30 min［5］。

儀器設備：CY-5D超聲波微生物生長促進儀；752N紫外可見分光光度計；Stemi 30電子顯微鏡；7890AGC氣相色譜；YXQ-LS-50S高壓滅菌鍋；HYL-C多功能搖床；NMR-500核磁共振譜儀；NDJ-79黏度計；S-3400N鎢燈絲掃描電子顯微鏡。

1.2實驗方法

1.2.1菌種發酵

將發酵液分裝至6個500 mL三角瓶中，精確量取20 mL菌液于發酵瓶，置于28℃恒溫培養箱中進行發酵培養。發酵初期每隔4 h取樣1次，發酵末期每隔10 h取樣1次。

1.2.2超聲波輔助酒精發酵

發酵7 h結束后，取其中3個三角瓶進行超聲波處理，處理的條件是超聲頻率20 KHz，超聲功率密度50 W/L，超聲時間1 h，工作10 s，間歇2 s。

1.3檢測方法

1.3.1酵母菌數目的測定

使用血球計數法結合美蘭染色法來確定酵母菌活菌的數量［12］。

1.3.2發酵液中殘糖含量測定

采用DNS［13］法（3，5-二硝基水楊酸法）測定。取5 mL發酵液，于5000 r/min離心機中離心10 min，取上清液于540 nm處測其吸光值，并繪制標準曲線，標準曲線為Y= 0.4824X+0.0123，R2=0.9978。對應標準曲線得出相應含量。DNS比色法測定葡萄糖質量濃度即為殘糖含量。

1.3.3發酵液中酒精含量測定

采用氣相色譜法［14］測定發酵液酒精含量。取2 mL發酵液，經0.45 nm濾膜過濾處理，與甲酸1∶1混合，使用氣相色譜儀進行測定，并繪制標準曲線，標準曲線為Y= 17309.0517X+7400.0464，R2=0.9993。

1.3.4發酵液黏度測定

取發酵前、中、后、末期的發酵液于5000 r/min離心機中離心10 min，取上清液使用NDJ-8S型號的旋轉黏度計測定黏度。

1.3.5發酵液水分子團17O半峰寬

本研究利用17O-NMR半峰寬研究超聲波處理方法對水分子團簇的影響，取發酵前、中、末期發酵液于5000 r/min的離心機中離心10 min，除掉底部沉淀物，將離心后的上清液經過30～50 μm的定性濾紙進行過濾處理得到濾液，采用NMR測定發酵液水分子團17O半峰寬。

1.3.6酵母細胞表面的掃描電鏡分析

取超聲波處理完成后的發酵液于5000 r/min的離心機中離心10 min，獲得底部菌體，并按以下步驟進行處理：

菌體→PBS清洗3次→2.5%戊二醛，4℃固定4 h→PBS清洗3次→乙醇梯度脫水（30%，50%，70%，80%，90%）1次→在15 min/次，5000 r/min，4℃下離心5 min，100%乙醇脫水2次→乙酸異戊二酯置換2次（1-醇∶酯= 1∶1，2-醇∶酯=1∶1）→樣品在超凈臺吹干，進行SEM觀察。

PBS：NaCl：5.0 g，Na2HPO4：2.9 g，KCl：0.2 g，KH2PO4：0.2 g。

干燥后的樣品在高度真空條件下進行黃金鍍層［15］，然后采用S-3400N型號的掃描電鏡進行觀察。

2　結果與分析

2.1超聲波對酵母菌數目的影響

觀察超聲組培養液發現，發酵8 h后超聲組三角瓶的底部出現少許沉淀，經鏡檢發現是酵母菌的菌體沉淀。通過圖1可以發現剛接入的菌體處于遲滯期，發酵不活躍，此時超聲組會略微落后于對照組。

對發酵過程酵母活菌數檢測可以看出（圖1），超聲組在發酵24 h后可達到最大活菌數量，為2.75×108cfu/mL，相比對照組提前18 h達到最大活菌數，兩組發酵液中的活菌數均在之后30 h內急速下降，直到發酵后期，兩組活菌數量基本不再變化。這一變化趨勢與糖含量的變化趨勢相吻合。證明在發酵底物一樣的情況下，低功率超聲波處理可以促進細胞快速生長，但對細胞最終數目沒有較大影響。此研究結果與高大維等［16］研究結果相一致，用頻率為32.5 KHz，功率為30 W的超聲輻照啤酒酵母后，細胞的對數生長期延長，細胞生長速率提高，對細胞生長有一定促進作用。這可能是由于超聲波在一定程度上可以改變細胞膜的通透性，加速胞內物質的流出和胞外物質的流入，從而促進細胞快速生長。

2.2超聲波對發酵液殘糖量的影響

酵母發酵過程中利用糖類產生二氧化碳和酒精，糖含量和超聲功率密度對發酵進程都有很大的影響［17-18］。發酵過程中糖含量的變化從側面反映了發酵進程。對發酵過程各組發酵液殘糖量的檢測可以看出（圖2），由于酵母菌不斷生長繁殖，消耗大量的糖從而產生酒精，發酵液中糖含量先快速下降，之后隨著發酵的完成保持緩慢變化。超聲組的發酵進程相比對照組提前40 h完成發酵。這一變化趨勢與發酵液中酵母菌活菌數的變化趨勢相吻合，這也進一步證明了超聲波處理能夠促進細胞的快速增長。

圖1　超聲波對發酵液酵母菌數量的影響

圖2　超聲波對發酵液殘糖量的影響

2.3超聲波對發酵液中酒精濃度的影響

對發酵液酒精濃度的檢測可以看出（圖3），隨著酵母菌不斷發酵消耗糖，兩組發酵液中酒精含量也在不斷升高。超聲組發酵液酒精濃度相比對照組提前20 h，在70 h達到最大濃度4.5 g/L。在30 h內酒精濃度會快速升高，發酵50 h后酒精濃度基本不再變化，而對照組的酒精濃度直到4 d后都在緩慢的升高。最終的超聲組酒精濃度要高于普通組。在酵母發酵后期，往往會由于生成較大的酒精濃度而抑制發酵進程。在超聲組中，酵母在較高的乙醇含量中快速地完成了發酵。

2.4超聲波對發酵液黏度的影響

從表1可以看出，隨著發酵進程的延續，酵母菌不斷生長繁殖，消耗發酵底物導致發酵液黏度逐漸降低。發酵后、末期黏度基本不再變化，超聲組發酵液黏度明顯低于對照組，一方面是由于超聲波處理加快酵母細菌的繁殖，促使發酵底物的利用，導致發酵液黏度降低，另一方面，超聲波處理促使水分子團變小進一步導致黏度降低，這一規律與超聲波處理可使水分子團變小、加快酵母生長的研究結果相一致。

圖3　超聲波對發酵液酒精濃度的影響

表1　超聲波對發酵液黏度的影響

2.5超聲波對發酵液水分子團的影響

通常情況下，水分子團簇是隨機、無定形的無規線團，而水的物理化學性質，比如黏度、溶解能力、滲透力等都由其分子團簇結構決定。目前，核磁共振波譜（NMR）是直接測試分子團簇結構的主要手段［19］。17ONMR半峰寬可以定性表征水分子團簇大小，半峰寬越大水分子團簇也越大。由表2可以看出，發酵初期對照組和超聲組發酵液水分子團17O半峰寬大小均為110 Hz，隨著發酵的進行，兩組水分子團大小均有減少，說明酵母發酵能夠使水分子團變小，但對照組減小的幅度沒有超聲組明顯，這也驗證了超聲波處理可以進一步打破水分子團，使之重新聚合成小分子團。水分子團越小，活性越大，水的溶解力、滲透力、代謝力、擴散力、乳化力均有所增強，而具有一定的“活化”作用，從一定程度上增強生物機體的新陳代謝能夠促進生命活力［10］，對細胞膜孔有比較好的滲透力，能夠很快滲入酵母細胞內，從而促進酵母細胞的生長。

表2　超聲波對發酵液水分子團的影響

2.6超聲波對酵母細胞表面變化的影響

從圖4可以看出，對照組的酵母細胞表面形體飽滿，沒有大的凹陷。相反，超聲組酵母細胞形體發生變化，不再飽滿圓潤，表面粗糙，出現一定程度的凹陷。這是由于超聲波處理可以造成細胞表面微傷，使細胞壁局部破裂，在一定程度上改變細胞膜的通透性，從而加速了胞內物質的流出和胞外物質的流入，進而加快了發酵的進程。這一研究結果與戴傳云等［20］和馮若等［21-22］的研究相一致，研究發現：低功率超聲波可以導致細胞的非熱生物效應，使細胞短時局部破裂而沒有破碎、死亡，說明它在不影響代謝反應速度的情況下，對細胞表面造成微小損傷，它可以很容易地被細胞自身所修復。

圖4　不同組酵母細胞表面

3　結論與展望

低強度的超聲波處理可以有效地促進酵母細胞生長，加速釀酒酵母的發酵過程。本研究所選用的釀酒酵母在28℃的條件下，設置超聲密度為50 W/L，超聲頻率為20 kHz，超聲時間1 h，發現酵母細胞的菌落總數迅速增加，與對照組相比，大約提前18 h達到最大菌落數，發酵后期2組酵母菌落數基本一致；超聲組與對照組相比，發酵過程提前40 h完成，酒精的最終產生量基本一致；同時研究發現，超聲波處理還能夠降低發酵液的黏度，減小水分子團簇，改變酵母菌細胞的形態，這些都有助于探究超聲波處理加速酒精發酵的機理。

目前，我國食品加工的總體水平還有待提高，新工藝和新技術的研究與推廣必將推動我國現有食品加工技術的進步。將超聲波應用于食品工業，不僅技術簡單，易于實現，而且減少了設備的投入，因此它在發酵工程領域的應用前景是十分廣闊［23］。本研究為超聲波處理技術在生物發酵工藝方面的應用提供了理論依據，但是對于超聲ih促進酒精發酵的機制研究還未很透徹，需要進一步的研究。

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優先數字出版時間：2016-05-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160503.1410.008.html。

中圖分類號：TS264；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0023-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016083

基金項目：國家863計劃：（2013AA102203）；江蘇省科技支撐項目（BE2013404）；鎮江市農業科技支撐項目（NY2012013）。

收稿日期：2016-03-10

作者簡介：王振斌（1975），男，陜西咸陽人，博士，教授，主要研究方向：食品物理加工技術。

Ultrasound-Assisted Alcohol Fermentation Technology

WANG Zhenbin，LIU Fengye，MAHaile，WANG Lin，ZHANG Cunsheng，YAN Jingkun and LIU Jiayou
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China）

Abstract:In order to promote the development of liquor-making technology，the mechanism of ultrasonic treatment to advance alcohol fermentation was explored.Based on the change in yeast amount，residual sugar content in fermenting liquid，ethanol yield，and fermenting liquid viscosity before and after ultrasonic treatment，the surface features and water clusters of yeasts before and after ultrasonic treatment were studied by SEM and NMR.The results showed that，in control group，yeast amount and alcohol content reached up to 2.86×108cfu/mL at 42 h and 4.5 g/L at 90 h respectively，fermenting liquid viscosity reduced gradually，the surface of yeast was well-stacked with no defect and no big sag，and17O half-peak breadth of water clusters was 85.39 Hz；in ultrasonic treatment group，yeast amount reached up to the maximum number of 2.75×108cfu/mL 18 hours in advance，and the consumption rate of reducing sugar and ethanol yield significantly increased，fermenting liquid viscosity was evidently lower than that in the control group，and the surface of yeast was rough and with big sag on the surface，and17O halfpeak breadth of water clusters was 54.32 Hz.This study provided a theoretical evidence for the application of ultrasonic treatment in biological fermentation.

Key words:alcohol fermentation；ultrasonic treatment；fermentation speed；mechanism