黑曲霉F5菌株產高溫糖化酶的液體發酵優化分析

常呂珍，楊云娟，2，張潤美，李萬軍，牟興玲，黃遵錫，2，唐湘華，2

（1.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650500； 2.云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，云南昆明650500）

黑曲霉F5菌株產高溫糖化酶的液體發酵優化分析

常呂珍1，楊云娟1，2，張潤美1，李萬軍1，牟興玲1，黃遵錫1，2，唐湘華1，2

（1.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650500； 2.云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，云南昆明650500）

摘要：實驗通過對黑曲霉F5菌株進行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽的篩選及正交優化，結果表明，發酵培養基最優條件為：30%馬鈴薯汁，2%蛋白胨，0.4%磷酸二氫銨，pH4.5，在30℃下發酵培養4 d糖化酶活力達到87.3 IU/mL；糖化酶的最適反應溫度為65℃，pH5.0。

關鍵詞：黑曲霉； 糖化酶； 篩選； 優化

糖化酶（Glucoamylase，EC 3.2.1.1）又名葡萄糖淀粉酶，是一種酸性糖苷水解酶，從淀粉或者淀粉類似物的非還原端按順序切開α-1，4糖苷鍵，也能水解α-1，6糖苷鍵、α-1，3糖苷鍵，產生葡萄糖。一般淀粉水解程度達80%。目前，糖化酶被廣泛用于燃料乙醇、固態白酒、抗生素、有機酸、淀粉糖、飼料行業，是應用和工業酶學領域使用最廣泛的酶制劑之一［1-4］。而黑曲霉則是生產糖化酶的重要菌株之一［5-6］。多年來，糖化酶的研究工作多集中在產酶能力的選育、基因分子水平的改造和發酵條件的優化。梁新紅［7］、宋水山［8］、陳冠軍［9］等人對黑曲霉產糖化酶的研究中獲得不同變異菌株黑曲霉代謝分泌形成的糖化酶最適反應溫度在40～60℃，但用于工業化生產時多在40℃條件下進行。本實驗工作采用自行篩選的黑曲霉F5進行產高溫糖化酶的研究，力圖在云南固態發酵小曲酒工藝中進行糖化工藝的調整，采用高溫糖化酶加速原料的預處理，再接種根霉提高根霉的糖化效率，使酵母代謝途徑加速流向酒精發酵終端。

本研究針對產高溫糖化酶的黑曲霉F5菌株進行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽［10-13］的優化實驗，以期望尋找耐酸、耐高溫的糖化酶用于淀粉質原料預處理，降低能耗，提高DE值，簡化生產工藝。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

實驗菌株：黑曲霉F5來自富士山火山口土樣，由云南師范大學微生物實驗室選育。

基礎培養基［15］：MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、KCl 1 g、瓊脂20 g、pH值自然、水1000 mL。

查氏培養基［15］：NaNO32 g、KCl 1g、磷酸氫二鉀0.1 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、pH值自然、水1000 mL。

儀器設備：移液槍、磁力攪拌器、離心機、電熱恒溫培養箱、超凈臺、高壓滅菌鍋、搖床、渦旋振蕩器、紫外分光光度計。

1.2黑曲霉F5種子平板制備

配制查氏培養基，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，在超凈臺中倒平板，并將已純化好的F5菌株接種于該平板培養基中，放置于30℃恒溫培養箱中培養3 d，獲得黑曲霉F5的孢子平板。

1.3葡萄糖標準曲線的制作

參考文獻按［14］進行標準曲線的制作［14］。

1.4高溫糖化酶活力測定

取3支試管，分別編號為空白管、樣品管A、樣品管B，向3支管中分別加入pH5.0的1%可溶性淀粉底物1.8 mL，65℃保溫5 min；向樣品管A、B中加入一定稀釋梯度的待測酶液0.2 mL，65℃精確保溫15 min后加入3 mL DNS試劑終止反應，混合均勻；另向空白管中補加待測酶液0.2 mL；將3支管放入沸水浴中煮沸5 min，流水冷卻，加入10 mL蒸餾水，渦旋振蕩器上混勻，540 nm下測定吸光度。

酶活定義：在pH5.0、65℃條件下，1 mL酶液每1 min水解1%的淀粉底物產生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位，用U表示。

1.5最適反應溫度、最適反應pH值的篩選

向基礎培養基中加入馬鈴薯汁20%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，以121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

最適反應溫度的測定：取過濾的發酵液經適當稀釋后分別在反應溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃條件下進行反應，按照1.4步驟進行酶活測定。

最適反應pH值的測定：取過濾的發酵液經適當稀釋后分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的1%淀粉底物中，按照1.4步驟進行酶活測定。

1.6碳源的選擇

1.6.1不同碳源的選擇

向基礎培養基中分別加入馬鈴薯汁20%、小麥淀粉2%、可溶性淀粉2%、玉米淀粉2%、木薯淀粉2%、糊精2%6種選擇性碳源，在每種培養基中再補加硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.6.2碳源不同濃度梯度的篩選

2組碳源培養基的配制：向基礎培養基中分別加入馬鈴薯汁：10%、15%、20%、25%、30%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然；小麥淀粉：0.5%、1%、2%、4%、6%；硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然。將2組配制好的培養基在121℃、0.1 MPa條件下同時滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.7氮源的選擇

1.7.1不同氮源的選擇

向基礎培養基中分別加入蛋白胨0.5%、尿素0.5%、明膠0.5%、硝酸銨0.5%、硫酸銨0.5%、硝酸鈉0.5%；馬鈴薯汁25%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.7.2氮源不同濃度梯度的篩選

向基礎培養基中分別加入蛋白胨0.5%、1%、2%、4%、6%；馬鈴薯汁25%，磷酸氫二鉀0.1%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.8磷酸鹽的選擇

1.8.1不同磷酸鹽選擇

向基礎培養基中分別加入磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鈉0.1%、磷酸二氫銨0.1%、磷酸鈣0.1%；馬鈴薯汁25%，蛋白胨2%，pH值自然，121℃，0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.8.2磷酸鹽不同濃度梯度的篩選

向基礎培養基中分別加入磷酸二氫銨0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%；馬鈴薯汁25%，蛋白胨2%，pH值自然，121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

1.9黑曲霉F5正交試驗

以馬鈴薯汁、蛋白胨、磷酸二氫銨、pH值為4個因素，分別做3個水平，進行正交試驗，見表1。

表1　 因素水平表

取27個300 mL錐形瓶，按照正交表4個因素配制正交培養基，以121℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活。

2　結果與討論

2.1葡萄糖標準曲線的制作（圖1）

圖1　葡萄糖標準曲線圖

由圖1可知，葡萄糖標準曲線為y=1.002x+0.002，R2= 0.99992＞0.95，線性關系顯著，可用于后續研究工作。

2.2最適反應溫度、最適反應pH值的篩選（圖2、圖3）

圖2　最適溫度篩選結果圖

圖3　最適pH值篩選測定結果圖

由圖2、圖3可知，黑曲霉F5菌株最適溫度為65℃，低于50℃以下會導致酶活性不足，高于80℃則酶蛋白變性失活；最適pH值為5.0，pH值在4～6之間，酶活力能保持80%以上，比較適合與淀粉酶配合使用，用于糖化工藝。

2.3碳源的選擇

如圖4所示，馬鈴薯汁和小麥淀粉產生的酶活最高，可采用馬鈴薯汁和小麥淀粉作為主要的碳源；圖5表明，小麥淀粉在濃度大于2%后，隨著濃度的升高，酶活力逐漸降低，而隨著小麥淀粉濃度的升高，酶活力降低的原因可能是培養基濃度升高，黑曲霉生長過于旺盛，大量形成菌絲體，產酶代謝途徑受到抑制，產酶能力降低；而馬鈴薯汁在大于20%后，酶活力還有明顯的增加趨勢，其原因可能是因為馬鈴薯汁中含有某些氨基酸或者維生素，促進了黑曲霉的生長，其代謝產物也有一定的提升，促使酶活力也呈上升趨勢。因此，在碳源的選擇上使用馬鈴薯汁作為最佳碳源是最適合的，且濃度為25%，產酶能力最高。

圖4　不同碳源酶活力測定結果圖

圖5　兩種碳源不同濃度梯度酶活力測定結果圖

2.4氮源的選擇（圖6）

圖6　不同氮源酶活力測定圖

由圖6所示，采用的6種氮源中蛋白胨為F5最佳氮源，這與趙林果等［16］在研究碳源和氮源對黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影響中蛋白胨為最佳氮源相一致。該菌株F5對尿素氮源不利用，生長不佳，產生的糖化酶活力不高，這與張秋菊等［17］在探討固態發酵中不同碳源和氮源對黑曲霉解磷效果的影響，尿素的發酵液中有效磷含量有所減少相一致，而作為有機氮源，反而有助于F5菌株的生長和產酶。以蛋白胨為優化氮源，蛋白胨濃度添加量為2%時酶活力較高，實驗選擇濃度2%蛋白胨作為最佳氮源。隨著蛋白胨濃度的增加，大量的氮源用于菌絲體的生長，延長了生物量的繁殖時間，導致產酶階段延后甚至不利于產酶（見圖7）。

圖7　氮源不同濃度梯度酶活力測定圖

2.5磷酸鹽的選擇（圖8、圖9）

圖8　不同磷酸鹽酶活力測定圖

圖9　磷酸鹽不同濃度梯度酶活力測定圖

由圖8可以看出，5種磷酸鹽中，磷酸二氫銨酶活力最高，磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉酶活力相差不大，表明其對產酶影響不大，而磷酸鈣產生的酶活最低，其主要原因可能是磷酸鈣為沉淀物質，不利于黑曲霉F5菌絲體的吸收利用，而磷酸二氫銨中可能存在著氮源，導致生長過程中促進產酶，因而酶活力最高。在以優化磷酸二氫銨濃度中，當磷酸二氫銨濃度為0.4%時，酶活力最高（見圖9）。

綜上所述，F5菌株最佳碳源為馬鈴薯汁，濃度為25%；最佳氮源為蛋白胨，濃度為2%；最佳磷酸鹽為磷酸二氫銨，濃度為0.4%。形成的粗酶的最適反應溫度為65℃，最適反應pH5.0。

2.6黑曲霉F5正交試驗

由4因素3水平進行了正交試驗，結果見表2。

表2　L9（3）4正交試驗結果

由表2進行直觀分析可知，根據R極值大小可看出，

RpH值＞R蛋白胨＞R磷酸二氫銨＞R馬鈴薯汁，說明pH值對產酶能力影響最顯著；馬鈴薯汁影響效果最弱。從水平因子考慮，其最優組合形成的最佳培養基配比為：馬鈴薯汁30%，蛋白胨2%，磷酸二氫銨0.4%，pH4.5。

2.7驗證試驗

取4個三角瓶分別編號為1號、2號、3號、4號，配制4瓶培養基：馬鈴薯汁30%，蛋白胨2%，磷酸二氫銨0.4%，pH4.5，在121℃、0.1 MPa下滅菌30 min，冷卻，接種培養3 d的1 cm2左右F5孢子菌絲體，在30℃、188 r/min條件下搖床培養4 d，測定酶活（見表3）。

表3　 驗證試驗結果

通過補充驗證試驗，看其生長穩定性及產酶穩定性，酶活比正交試驗優化實驗高8.7%左右，3個樣品產生的酶活平均范圍為87.3 IU/mL±4.7 IU/mL。

3　結論

本實驗通過對黑曲霉F5菌株進行了溫度、pH值、碳源、氮源、磷酸鹽的篩選及正交試驗優化，結果表明：發酵最佳碳源為30%馬鈴薯汁；最佳氮源為2%蛋白胨，最佳磷酸鹽為0.4%磷酸二氫銨，最適pH4.5，通過發酵產酶以后最高酶活能達到87.3 IU/mL，發酵產生的糖化酶最適反應溫度為65℃，最適pH5.0。根據以上數據，最適反應溫度為65℃的糖化酶可采用中溫蒸煮和低溫蒸煮同步進行，用于液態白酒的生產。在白酒的生產過程中，通過添加該糖化酶能降低能耗，縮短反應時間，其酶穩定性及其應用將在后續工作中完成。

［1］李冰潔.黑曲霉變異株Sp-56在糖化酶生產工業中的應用［J］.微生物學雜志，1995（1）：16-20.

［2］Giordano R L C，Trovati J，Schmidell W.Continuous production of ethanol from starch using glucoamylase and yeast co-immobilized in pectin gel［J］.Applied Biochemistry& Biotechnology，2008，147（1）：47-61.

［3］Kumar P，Satyanarayana T.Optimization of culture variables for improving glucoamylase production by alginate-entrapped Thermomucor indicae-seudaticae using statistical methods［J］. Bioresource Technology，2007，98（6）：1252-1259.

［4］王海燕，秦浚川，王敖全，等.黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因對工業酒精酵母的整合及其共表達［J］.微生物學報，2004，44（4）：483-485.

［5］單海艷.黑曲霉生產糖化酶及酶活測定［J］.牡丹江大學學報，2010，19（7）：92-94.

［6］Wallis G L F，Swift R J，Hemming F W，et al.Glucoamylase overexpression and secretion inAspergillus niger:analysis of glycosylation［J］.Biochimica et BiophysicaActa，1999，1472 （3）：576-586.

［7］梁新紅，孫俊良，唐玉，等.黑曲霉糖化酶分離純化與酶學性質研究［J］.河南科技學院學報：自然科學版，2011，39（4）：24-27.

［8］宋水山，浜田信威，竹西繁行.黑曲霉糖化酶的純化及特性鑒定［J］.河北省科學院學報，1992（1）：57-64.

［9］陳冠軍，曹淑桂，羅貴民，等.黑曲霉糖化酶熱穩定性的研究［J］.中國生物工程雜志，1990（3）：29-33.

［10］孫俊良，李新華，梁新紅，等.不同碳源對黑曲霉產糖化酶活力的影響［J］.食品科學，2008，29（08）：433-436.

［11］孫繼祥.黑曲霉產糖化酶液態發酵條件優化［J］.釀酒科技，2011（10）：45-47.

［12］鐘浩，譚興和，熊興耀，等.黑曲霉固態發酵產糖化酶的研究［J］.中國釀造，2009（1）：26-29.

［13］賀瑩，高麗芳，焦紅英.黑曲霉產糖化酶固態發酵營養條件優化研究［J］.中國釀造，2013，32（9）：88-90.

［14］孔維瑞，郭福宗，唐湘華，等.產糖化酶根霉菌的分離及其酶學性質研究［J］.釀酒科技，2012（9）：32-35.

［15］沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學實驗［M］.3版.北京：高等教育出版社，1996.

［16］趙林果，游麗金，倪浩，等.碳源和氮源對黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶的影響［J］.南京林業大學學報：自然科學版，2009，32 （6）：1-4.

［17］張秋菊，王伯鐸，葉勁松，等.固態發酵中碳氮源對黑曲霉解磷效果的影響［J］.現代農業科技，2010（21）：293-295.

優先數字出版時間：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1550.010.html。

中圖分類號：TS261.1；Q93-3；TS262.3；TQ92

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0032-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016003

基金項目：2014年云南師范大學大學生科研訓練基金項目。

收稿日期：2016-01-06

作者簡介：常呂珍（1990-），女，云南鎮雄人，在讀本科，生物技術專業。

通訊作者：唐湘華（1973-），男，講師，從事應用微生物發酵工程研究，E-mail：txhact@gmail.com。

Optimization of the Liquid Fermentation Conditions of Aspergillus Niger Strain F5 to Produce Thermotolerant Glucoamylase

CHANG Lvzhen1，YANG Yunjuan1，2，ZHANG Runmei1，LI Wanjun1，MOU Xingling1，HUANG Zunxi1，2and TANG Xianghua1，2
（1.School of Life Sciences，Yun'nan Normal University，Kunming，Yun'nan 650500；2.Yun'nan Provincial Key Lab for Biomass Energy and Environmental Biotechnology，Kunming，Yun'nan 650500，China）

Abstract:In this study，the factors influencing the thermotolerant glucoamylase yield of Aspergillus niger strain F5，including temperature，pH value，carbon source，nitrogen source and phosphate salt，were investigated.The optimum culture medium was composed of 30%potato juice，2%peptone，and 0.4%ammonium dihydrogen phosphate with pH 4.5.After 4 d culture at 30℃，the activity of the produced glucoamylase reached up to 87.3 IU/ml.The best reaction temperature of glucoamylase was 65℃and the best reaction pH was 5.0.

Key words:Aspergillus niger；glucoamylase；screening；optimization