濃醬兼香型白酒不同儲存期的高溫大曲微生物群落結構與發酵特征分析

梁麗文，繆禮鴻，楊團元，張明春，劉蒲臨，王　霜

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023； 2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北松滋434200）

濃醬兼香型白酒不同儲存期的高溫大曲微生物群落結構與發酵特征分析

梁麗文1，繆禮鴻1，楊團元2，張明春2，劉蒲臨1，王霜1

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023； 2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北松滋434200）

摘要：選取白云邊酒不同儲存期的高溫大曲為研究對象，從微生物數量、細菌種類、發酵力和糖化力等方面的變化規律進行分析。結果表明，在120 d的儲存期內，隨著時間的延長高溫大曲細菌種類和數量以及霉菌的數量逐漸上升；大曲的發酵力整體呈緩慢上升的趨勢，而糖化力先增加后降低。Bacillus.methylotrophicus在大曲中分布最廣。大曲微生物數量與酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯的含量呈一定正相關。

關鍵詞：濃醬兼香型白酒高溫大曲； 儲存期； 微生物群落結構； 發酵特征

白云邊酒高溫大曲是一種經過自然接種、高溫發酵而制成的菌酶合一的糖化發酵劑［1］。酒曲中微生物的種類、數量、產酶特性在一定程度上決定著酒曲質量及其活性指標［2］。李丹宇等［3］發現在制曲過程中，糖化力、液化力、蛋白分解力與真菌數量和種類呈正相關，說明真核微生物對大曲生化酶類的生成有重要作用；總酸含量、蛋白分解力與細菌多樣性呈顯著相關。高溫大曲發酵好后需經3個月左右的儲存后才能使用。劉建文等［4］發現儲存3～4個月的大曲，其纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均達到最好狀態。大曲儲存期越長，越容易導致曲蟲危害，增加損耗和庫存成本。因此，縮短大曲的儲存期具有重要經濟價值。

濃醬兼香型白云邊酒大曲生產采用醬香型白酒高溫制曲工藝［5］。本研究對不同儲存期白云邊酒高溫大曲的微生物群落結構、理化性質與發酵特征進行了分析，旨在解析高溫大曲在儲存過程中的變化規律及微生物與發酵特性之間的關系，為合理設定大曲儲存時間及進一步研究如何縮短大曲儲存期提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

樣品：不同儲存期的高溫單塊大曲，混合大曲曲粉以及高粱，均由湖北白云邊酒業股份有限公司提供。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

馬丁-孟加拉紅培養基［6］。

LB液體培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母抽提物5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

主要試劑：細菌菌株DNA提取所需酶、Marker、dNTPs、Buffer等購于生工生物上海股份有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的處理方法

取不同儲存期的高溫單塊大曲粉碎，混合均勻并過20目篩后備用。

1.2.2菌株分離及計數方法

稱取大曲曲粉樣品10.0 g，加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，170 r/min搖床15 min，采用稀釋涂布平板法［6］依次涂布于馬丁孟加拉紅平板，牛肉膏蛋白胨平板。馬丁孟加拉紅平板置于生化培養箱中以30℃培養2 d，觀察，計數。牛肉膏蛋白胨平板置于生化培養箱中以37℃培養2 d，觀察，計數，然后從平板上挑取數量上占優勢且形態有差異的細菌菌落，經劃線分離純化、鏡檢，編號后保存備用。

1.2.3理化指標及測定方法

水分的測定：稱取待測大曲曲粉樣品3.0 g，用快速水分測定儀測定；發酵力的測定［7］：采用CO2失重法；糖化力的測定［7］：斐林試劑法。

1.2.4實驗室模擬大曲白酒固態發酵方法

（1）燜高粱1.5 h。水溫大于90℃，每澆淋1次后燜高粱30 min，共3次，燜高粱時蓋緊鍋蓋。

（2）蒸高粱90～120 min。含水量控制在55%，然后冷卻至25℃左右。

（3）將大曲以10%（質量比）的比例添加到攤涼的高粱中，混合均勻。

（4）將混合均勻的原料堆積后置于大塑料袋中，每個塑料袋約600 g，再置于37℃培養箱培養24 h，提高溫度至42℃培養12 h，再升溫至50℃培養12 h。分裝于菌種瓶中，裝滿后用8層保鮮袋封口，并做好標記。

（5）置于28℃恒溫恒濕培養箱中發酵，每隔7 d后取1瓶，即為酒醅。取部分酒醅蒸餾并進行氣相色譜分析。

蒸餾方法：取50.0 g酒醅，加入150 mL的蒸餾水，蒸出100 mL的蒸餾液，過濾后采用氣相色譜測定乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的含量。

1.2.5乙醇、正丙醇及乙酸乙酯的測定方法

采用氣相色譜測定法：氣相色譜安捷倫5890A。載氣流速25 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，分流比20∶1。起始柱溫為60℃，保持5 min，然后以10℃/min程序升溫至160℃，保持5 min。

1.2.6細菌DNA的提取

將分離到的細菌菌株在牛肉膏蛋白胨平板上多次活化，并劃線純化后接種到LB液體培養基中，于37℃、170 r/min下搖床培養14 h，用細菌基因組試劑盒提取基因組DNA，檢測后于-20℃保存備用。

1.2.7提取的細菌DNA的PCR擴增、分子測序和系統發育樹構建

細菌DNA采取試劑盒抽提后，PCR擴增16S rDNA，細菌的16S rDNA引物為27F和1492R。反應體系采用50 μL的反應體系。PCR循環程序為：94℃預變性5 min，94℃50 s，54℃50 s，72℃90 s，循環30次；72℃延伸10 min。擴增的細菌PCR產物送金唯智生物科技有限公司測序，測序長度在1400 bp左右，測序結果采用BioaEdit軟件序列圖譜人工校對拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列數據庫中進行同源序列搜索比對。根據同源序列搜索結果，選取測試菌株關系較近的模式菌株的16S rDNA序列區序列，用MEGA軟件采取鄰接法構建系統發育樹。

表1　不同儲存期的高溫單塊大曲理化指標及微生物數量分析結果

2　結果和分析

2.1不同儲存期的高溫單塊大曲理化指標及微生物數量分析結果

不同儲存期的濃醬兼香型白云邊酒高溫單塊大曲理化指標及微生物數量分析結果見表1。

由表1可知，儲存時間對大曲的含水率影響不大，其都在10%上下波動。大曲糖化力先升后降，在儲存120 d時達到最大值，與此同時霉菌數量也在120 d內逐步上升達到最高后下降，表明在120 d儲存期內大曲的糖化力與霉菌的數量之間具有明顯的正相關性。大曲的發酵力在整個儲存期內有所波動，但幅度不大，總體上呈緩慢上升趨勢，這與細菌和霉菌數量的變化不一致，表明高溫大曲的發酵力與細菌和霉菌數量之間沒有明顯的相關性。

由于同一儲存期的每塊大曲間存在一定波動性，因此選取了2個時間段的大曲粉碎車間的混合大曲曲粉進行進一步分析。不同儲存期的濃醬兼香型白云邊酒高溫混合大曲曲粉理化指標及微生物數量分析結果見表2。

表2　不同儲存期的高溫混合大曲曲粉理化指標及微生物數量分析結果

表2的數據顯示，細菌數和霉菌數量較高的120 d曲粉，發酵力和糖化力也高于30 d的曲粉，這與單個曲塊的測定的結果一致，表明單塊取樣雖然存在差異性，但仍可在一定程度上反映其大體變化趨勢。總體來說，儲存120 d的大曲發酵力和糖化力最強，適合生產白酒。

2.2不同儲存時間高溫單塊大曲的細菌種類分離鑒定

經稀釋涂布平板法和劃線分離純化法，從不同儲存期的大曲曲塊中共分離得到10株優勢細菌。其系統發育樹如圖1。這10株細菌分別與GenBank中1個屬的7種模式菌株的序列相似度均≥99%，分別為Bacillus licheniformis、Bacillus sp.、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus tequilensis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus methylotrophicus。不同儲存期大曲中細菌的種類見表3。

圖1　10株細菌基于16S rDNA基因序列的系統發育樹

表3　不同儲存期的高溫單塊大曲中細菌的種類

表3的數據顯示，不同儲存期曲塊的細菌種類差異比較大。細菌的種類由儲存期0 d大曲的1種增加到120 d的5種又降至180 d的1種。從整體趨勢上看，隨著時間的延長，細菌種類先逐漸增加，之后趨于單一。分離得到的細菌均為芽孢桿菌屬，其中，B.methylotrophicus為甲基營養型芽孢桿菌，存在于每種不同儲存期的大曲樣品中，是絕對的優勢菌株。

2.3不同儲存期大曲的實驗室模擬固態白酒堆積發酵結果

2.3.1儲存60 d和195 d的單塊大曲實驗室模擬固態白酒發酵結果

儲存60 d和195 d的大曲實驗室模擬固態白酒發酵酒醅中酒精度和正丙醇含量結果比較見圖2—圖4。

圖2　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中酒精度的變化比較

圖3　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中正丙醇含量的變化比較

圖4　添加60 d大曲和195 d大曲酒醅中乙酸乙酯含量的變化比較

由圖2數據看出，在裝瓶發酵23 d后，添加195 d大曲的酒醅中酒精含量高于添加60 d大曲的酒醅。這一結果與2.1中對大曲的發酵力測定結果相一致。由圖3和圖4數據可知，在裝瓶發酵的不同時間段，添加195 d大曲的酒醅中正丙醇和乙酸乙酯的含量高于添加60 d大曲的酒醅。

2.3.2儲存30 d和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態白酒發酵結果

儲存30 d的混合大曲曲粉和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態白酒發酵酒醅中微生物數量比較見表4。

表4　不同儲存期的混合大曲曲粉實驗室模擬固態白酒酒醅中微生物數量比較

由表4數據可知，在堆積結束后，酒醅中已檢測到較多酵母菌，所添加的曲粉中卻未檢測到酵母菌，證實了白酒釀造過程中酵母菌來源于空氣、原料和工廠車間這一結論。堆積結束后添加120 d曲粉酒醅中，酵母菌數量略低于30 d的曲粉，細菌數較高。到發酵30 d后，120 d曲粉酒醅中酵母菌數和細菌數均高于30 d的曲粉。

儲存30 d和120 d的混合大曲曲粉實驗室模擬固態白酒發酵酒醅中酒精度、正丙醇含量和乙酸乙酯含量結果比較見圖5—圖7。

圖5　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中酒精度的變化比較

圖6　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中正丙醇含量的變化比較

上述結果表明，儲存120 d曲粉的發酵酒醅中乙醇、正丙醇和乙酸乙酯濃度均高于儲存30 d曲粉發酵的酒醅，而發酵結束后120 d曲粉的發酵酒醅中微生物數量也高于30 d曲粉發酵的酒醅，表明酒醅中酵母菌數量是出酒率和酒質的直接體現，這與劉俊超等［8］的結果相一致。

圖7　添加30 d曲粉和120 d曲粉酒醅中乙酸乙酯含量的變化比較

3　討論

本研究表明，在一定的有效儲存期內，高溫大曲細菌種類和數量及霉菌的數量不降反增，這一結果與張秀紅等［9］報道的結果相似，而與大曲儲存是減少產酸菌的數量的認知相反［7］。大曲的發酵力整體呈緩慢上升的趨勢，與傳統觀念“大曲存儲時間越長，發酵力越弱”不一致，推測可能與大曲中還存在其他未培養的微生物與發酵力有關。本研究從白云邊不同儲存期的各高溫大曲樣品中均能分離到B.methylotrophicus。游玲等［10］發現，B. methylotrophicus在釀造車間分布很廣，其耐受乙醇及乙酸能力較好，并有報道［11］表明其可分解甲醇，可能有助于降低糟醅中的甲醇含量。該菌種在傳統大曲酒釀造過程中的功能有待進一步研究。

本實驗結果說明白云邊高溫大曲儲存120 d的大曲在出酒率及產酯率方面均優于儲存30 d的大曲，這與傳統大曲酒廠普遍采用儲存120 d左右的成曲進行大曲酒發酵的實踐相一致。在120 d儲存期內，隨儲存期的延長，霉菌的數量、糖化力均明顯增加，從而提高了出酒率。這一結果與之前研究得出的白云邊混合大曲的霉菌和酵母菌數量與其酒化力成正相關的結論相一致［12］。

從白云邊高溫大曲儲存期的微生物數量及種類的結果分析來看，高溫大曲發酵存在一個明顯的后發酵期，即高溫發酵期過后，隨著大曲品溫的下降，中溫型的霉菌和細菌開始緩慢生長，導致糖化率明顯增加。這種微生物種類及數量的增加可能是由于大曲自身的微生物進行恢復性生長，也可能是外來的曲房環境中的微生物在大曲表面生長引起的，其機理有待深入研究。

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優先數字出版時間：2016-05-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160512.1533.005.html【DOI】10.13746/j.njkj.2016。

中圖分類號：TQ925.7；TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0037-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016084

基金項目：湖北省重大科技創新計劃項目資助（2013ABA008）。

收稿日期：2016-03-10

作者簡介：梁麗文（1991-），女，湖北仙桃市人，碩士研究生，E-mail：110liangliwen@sina.com。

通訊作者：繆禮鴻，教授。

Microbial Community Structure and Fermentation Characteristics of High-Temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu in Different Storage Periods

LIANG Liwen1，MIAO Lihong1，YANG Tuanyuan2，ZHANG Mingchun2，LIU Pulin1and WANG Shuang1
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023；2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.Ltd.，Songzi，Hubei 434200，China）

Abstract:In this study，high-temperature Daqu of Baiyunbian liquor in different storage periods was used as the research object.The change rules of microbes quantity，bacteria varieties，fermenting power and saccharifying power were summed up.The results suggested that，within 120 d storage period，bacterial varieties and quantity and mold quantity in high-temperature Daqu increased gradually with the storage time，the fermenting power of Daqu increased slowly，and the saccharifying power of Daqu increased at the beginning and then dropped.Bacillus methylotrophicus had the widest distribution in Daqu.And the quantity of microbes in Daqu was positively correlated with the content of ethanol，normal propyl alcohol and ethyl acetate in fermented grains.

Key words:high-temperature Daqu for Nongxiang-Jiangxiang Baijiu；storage time；microbial community structure；fermentation characteristics