大曲蛋白酶對固態釀酒發酵的影響

向雙全，周志剛，張志剛，黃應予，劉麗娟，王　蕾，侯花寧，周瑩瑩（1.甘肅省固態發酵工程技術研究中心甘肅徽縣74308； .金徽酒股份有限公司技術中心甘肅徽縣74308）

大曲蛋白酶對固態釀酒發酵的影響

向雙全1，2，周志剛1，2，張志剛1，2，黃應予1，2，劉麗娟2，王蕾2，侯花寧2，周瑩瑩2
（1.甘肅省固態發酵工程技術研究中心甘肅徽縣742308； 2.金徽酒股份有限公司技術中心甘肅徽縣742308）

摘要：在傳統濃香型固態釀酒工藝的基礎上，采用響應面法對影響釀酒出酒率的關鍵響應因子進行了研究和探討。用統計學方法建立了出酒率與糟醅酸度、水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項式數學模型，并通過分析模型方程和3D響應圖得到本實驗方案固態釀酒出酒率最佳條件，即糟醅酸度A為1.87度，糟醅水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。在此最佳條件下出酒率最高達到48.1%。

關鍵詞：酸度； 水分； 大曲蛋白酶； 出酒率； 白酒

大曲蛋白酶是一種復合型蛋白酶，具有在酸性、中性、堿性條件下保持酶活力的特點，它是制曲過程多種微生物的代謝產物。在固態釀酒發酵過程中大曲蛋白酶具有促進原料溶解，分解蛋白質，生成氨基酸，提供氮源促進微生物繁殖生長，降解酵母菌體，提高原料利用率，提供生香前驅物質和風味組分，協同其他微生物共酵，抑制大量雜醇油的生成，提高原酒產量和質量等重要作用［1-10］。

在傳統固態白酒釀造過程中經常會出現原料利用率越來越低，發酵升溫幅度逐漸下降，發酵程度越來越不完全，致使發酵結束后糟醅酸度、殘糖、殘淀越來越高，出酒率和質量下降的惡性循環狀態。究其主要原因，一方面是蛋白質對淀粉的包裹作用，阻礙大曲液化酶、糖化酶對淀粉的充分水解；另一方面是由于蛋白質未被水解，發酵需要的氮源嚴重缺乏，影響釀酒微生物的繁殖代謝，特別是酵母菌的對氮源的需求［11］。大曲中蛋白酶活力適宜的情況下，包裹淀粉的蛋白質層結構會被破壞，使淀粉被糖化；另一方面，蛋白質水解，增加了氮源，有利于釀酒微生物，特別是酵母菌的代謝繁殖，使糟醅的不利狀況會逐漸改善，達到正常生產水平。本研究通過Design Expert8.05b（Box-Behnken）實驗設計進行響應面［12-14］優化了大曲蛋白酶在固態釀酒中的最佳酸度和水分配合發酵條件，充分發揮其在固態釀酒發酵過程中的作用，旨在使固態糟醅發酵過程中各種微生物能協調平衡代謝，提高固態白酒的產質量。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

中溫大曲；酸性蛋白酶，10萬U/g；高粱；大米；糯米；玉米；小麥；稻殼。將5種糧食粉碎，糧粉過20目篩的小于20%，配比按高粱∶大米∶糯米∶小麥∶玉米比例為38% ∶22%∶20%∶12%∶8%進行混合。大曲粉碎后曲粉過20目篩的小于36%。

試劑：蒸餾水、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純，國藥試劑公司）。

儀器設備：T6紫外-可見分光光度計，普析通用公司；電子天平，梅特勒-托利多；生化培養箱；恒溫水浴鍋；粉碎機；5 L自制蒸酒設備一套。

1.2實驗方法

1.2.1大曲蛋白酶活力的測定［15］以及大曲蛋白酶活力的調整

由于傳統固態釀酒過程中，糟醅發酵始終在酸性條件下進行，所以本實驗在酶活力測定時選擇pH值為3.0，采用福林酚法。參照中華人民共和國專業標準蛋白酶活力測定法（SB/T 10317—1999）。大曲蛋白酶活定義為1 g干重大曲在40℃、pH值為3.0條件下1 min水解干酪素產生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量為1個酶活力單位（U）。在測得大曲蛋白酶活力的基礎上，根據需要調整到的大曲蛋白酶活力，計算需要添加的蛋白酶重量，最終得到需要的大曲含蛋白酶活力的曲藥。

1.2.2糟醅水分調整方法

根據蒸好的糧糟總重量以及需要調整到的水分含量，計算出該加多少數量的開水。

1.2.3糟醅酸度的測定以及酸度調整方法

糟醅酸度的定義：10 g糟醅消耗0.10 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫摩爾數，即，消耗1 mmol氫氧化鈉標準溶液為1度。糟醅酸度的調整是根據入窖糟醅的總重量以及需要調整到位的糟醅酸度，計算出需要加入到開水中的乳酸質量，最后加入到蒸好的糧糟中。

1.2.4出酒率的測定

糟醅發酵10 d后，取出拌糠蒸餾，用500 mL的量筒接酒，同時在量筒中放入溫度計和酒精計，當量筒中的酒精度降到60%vol時，停止接酒，記錄出酒數量，按60%vol折算計算出酒率。

1.2.5釀酒固態發酵步驟及響應面實驗設計

固態發酵實驗步驟：取1 kg混合糧粉，加入600 mL溫水潤糧30 min，加入250 g熟稻殼，混勻，在蒸酒設備上大汽蒸煮70 min后出甄，出甄后加入80℃熱水。通過調整加入熱水的量來控制發酵糟醅水分；同時通過在熱水中加入不同量的乳酸來控制發酵糟醅的酸度。加入熱水燜潤15 min后，攤開糟醅冷卻，當溫度降到20℃時加入大曲粉250 g，通過往大曲粉里添加酸性蛋白酶控制發酵大曲的蛋白酶活力。最后收堆密封，放入27℃培養箱中恒溫發酵10 d，再取出發酵后糟醅，測定糟醅酸度、水分、殘糖、殘淀，并蒸餾取酒，計算出酒率。

根據濃香型白酒釀造工藝，確定了五糧比例，糟醅淀粉含量24%左右，25%的用曲比例和25%稻殼比例以及在培養箱中27℃恒溫發酵10 d蒸酒，根據濃香型白酒釀造工藝中糟醅入窖酸度和水分控制范圍［16］的基礎上，采用Design Expert8.05b軟件設計實驗，選取發酵糟醅的初始水分、酸度、蛋白酶活力為3個評價因素，出酒率為響應值，設計3因素3水平的響應面分析實驗，因素與水平見表1。

表1　實驗因素水平及編碼

2　結果與分析

2.1響應面實驗設計和顯著性分析

實驗設計和數據利用Design Expert8.05b（Box-Behnken）軟件處理，用F（Fischer）檢驗評價數學模型方程的顯著性，方程的擬合性由確定系數R2確定，以確立固態發酵過程中糟醅酸度、水分以及大曲蛋白酶活力的最佳配比，結果見表2。

表2　Box-Behnken實驗設計方案及結果

利用Design Expert8.05b軟件對實驗結果進行方差分析，結果見表3。通過對數據進行多元回歸擬合，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=46.06-3.93A+ 1.84B-0.59C-0.30AB+0.35AC-0.17BC-8.87A2-3.29B2-4.34C2，用該回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，R2= 0.9384，說明了93.84%的響應值變化是由該模型決定的，R值為0.9732說明實驗中出酒率與模型預測值有97.32%的一致性，由此表明該模型對實驗結果能進行較準確的預測。模型的顯著水平P＜0.01，此時二次回歸方程是極顯著的，方程對實驗擬合較好，因此可用此模型對響應面進行分析和預測。通過比較方程一次項系數絕對值大小，可以判斷在本實驗工藝參數中，酸度和水分達到極顯著水平，交互項不顯著，二次項均達到極顯著水平。由表3可知，A的P值為0.001，B的P值為0.0002，C的P值為0.0141，說明各自變量在設定的取值范圍內單因素對出酒率的影響順序為A＞B＞C。失擬項P=0.1379＞0.05，未達到顯著水平，表明實驗設計合理，該模型能準確描述各變量因素與響應值之間的關系。

表3　回歸模型與方差分析

圖1　酸度和水分對出酒率影響的響應面圖

圖2　酸度和大曲蛋白酶活力對出酒率影響的響應面圖

圖3　水分和大曲蛋白酶活力對出酒率影響的響應面圖

2.2響應面的分析與優化

通過模型方程得出的響應面圖、等高線圖結果見圖1、圖2、圖3。由圖1—圖3可知，糟醅酸度、大曲蛋白酶活力兩因素間的交互作用大于AB以及BC之間的交互作用；其結果與擬合方程中交互項系數的絕對值大小關系一致。根據等高線的形狀可以判斷交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，圓形則表示兩因素間交互作用不顯著，由圖1—圖3可以看出，等高線均呈橢圓形，說明各兩因素間的交互作用較強。由此可以說明在固態釀酒過程影響出酒率的因素中，大曲蛋白酶活力的影響不可忽視，在固態釀酒工藝參數范圍內大曲蛋白酶活力僅次于糟醅酸度對出酒率的影響，且大于糟醅水分對出酒率的影響，由此實驗可以說明大曲蛋白酶活力在固態釀酒過程中的重要作用及地位。

2.3模型驗證

對擬合的二次多項式回歸方程分別求A、B、C的偏導數，可得各個因素的極值點：

A=1.87，B=52.77，C=14.37。

同時Design Expert8.05b軟件推薦的出酒率最大的最佳組合因素條件為：

A=2.0，B=52.0，C=15.0。

可以看出，兩種模式推出的工藝參數最佳組合相近，再次驗證了該模型的可靠性。即以各因素極值為準，糟醅固態發酵出酒率最高的考察因素組合為：入窖酸度A 為1.87度，入窖水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。以上述得到的最佳因素值進行修正再進行實驗，即入窖酸度1.90度，入窖水分53.0%，大曲蛋白酶活力14 U進行3次平行實驗，結果見表4。由表4可知，出酒率的預測值為48.8%，實驗平均值為47.27%，相對誤差為3.24%，在模型允許的誤差范圍內，說明模型能很好地預測實際出酒率情況，該響應面分析方法可靠。

表4　最優條件下出酒率的預測值與實驗值的比較

3　結論

本實驗在傳統固態釀酒工藝控制要點的基礎上，固定其他工藝要素，選擇糟醅酸度、水分、大曲的蛋白酶活力3個因素，應用響應面法對3因素進行優化，借助Design Expert8.05b軟件，用統計學方法建立了固態釀酒出酒率與糟醅酸度、水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項式數學模型，并通過分析模型方程和3D響應圖得到本實驗方案固態釀酒出酒率最佳條件，即糟醅酸度A為1.87度，糟醅水分B為52.77%，大曲蛋白酶活力C為14.37 U。通過對模型方差分析和響應面3D圖分析，可以看出在固態釀酒過程中糟醅酸度與大曲蛋白酶活力的交互作用強于糟醅酸度與糟醅水分的交互作用，根據作者多年的釀造經驗，曲香正的大曲，大曲蛋白酶活力較大，氨基酸含量高，由此可確定在傳統釀酒過程中大曲質量的重要性和意義。

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優先數字出版時間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1206.010.html。

中圖分類號：TS262.3；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0047-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016119

基金項目：甘肅省科技廳科技計劃項目（144JTGK220）。

收稿日期：2016-04-08

作者簡介：向雙全（1979-），男，大學本科，工程師，主要從事白酒風味成分研究和白酒釀造工作。

Effects of Daqu Protease on Solid Fermentation of Baijiu

XIANG Shuangquan1，2，ZHOU Zhigang1，2，ZHANG Zhigang1，2，HUANG Yingyu1，2，LIU Lijuan2，WANG Lei2，HOU Huaning2and ZHOU Yingying2
（1.Gansu Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing，Huixian，Gansu 742308；2.Jinhui Liquor Co.Ltd.，Huixian，Gansu 742308，China）

Abstract:On the basis of traditional solid fermentation techniques of Nongxiang Baijiu，the key response factors influencing liquor yield were investigated by response surface method.Then the quadratic polynomial mathematical model of liquor yield，fermented grains acidity，fermented grains moisture content，and Daqu protease activity was set up by statistical method.And the best technical conditions were obtained through the analysis of model equation and 3D response diagram as follows:fermented grains acidity（A）=1.87，fermented grains moisture content（B）=52.77%，and Daqu protease activity（C）=14.37 U.Under above conditions，liquor yield reached up to 48.1%.（Trans.by YUE Yang）

Key words:acidity；moisture content；Daqu protease；liquor yield；Baijiu