尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的影響

韓露，張繼倬，陳興華

（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院心外科，北京 100038）

尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的影響

韓露，張繼倬，陳興華

（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院心外科，北京 100038）

目的探討尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的影響。方法40只新西蘭家兔隨機分為4組，對照組（A組）、缺血組（B組）、再灌注組（C組）、尼卡地平組（D組）。通過結扎冠狀動脈左側旋支40 min，開放120 min建立缺血再灌注模型。采用磷脂酰絲氨酸外翻分析方法（Annexin V法）檢測家兔心肌凋亡情況。結果病理切片提示D組心肌細胞受損情況明顯低于B組和C組（P＜0.01）。D組心肌細胞凋亡明顯少于B組及C組（均P＜0.01），但高于A組（P＜0.05）；D組心肌細胞壞死少于B組及C組（均P＜0.01），與A組比較無統計學差異（P＞0.05）。結論尼卡地平可以減少家兔缺血再灌注損傷所誘導的心肌細胞凋亡。

凋亡；尼卡地平；缺血再灌注；心肌細胞；Annexin V

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冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是影響人類健康的殺手之一，因病情嚴重需要行冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG）的患者越來越多，很多患者因為高齡，冠狀動脈病變嚴重，在手術麻醉誘導的時候會出現高血壓危象（特別是高血壓病Ⅲ級），導致心肌耗氧增加，從而發生急性心肌梗死等并發癥；另外心臟旁路移植手術能導致心臟缺血再灌注損傷，這些均是患者圍手術死亡的重要原因［1］。大量實驗及臨床觀察［2］表明心肌細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中起關鍵性的作用。尼卡地平注射液是第二代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，其靜脈制劑已經廣泛用于治療原發性高血壓和圍術期高血壓［3］。尼卡地平能否在術前起到心肌缺血預適應，術中、術后能否減輕患者的缺血再灌注損傷還不清楚。本實驗探討尼卡地平對家兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的影響。

1　　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器

新西蘭家兔40只［興隆實驗動物養殖廠，許可證SYXK（京）2011?0018普通級］。主要試劑包括尼卡地平［安斯泰來制藥（中國）有限公司］、Annexin V（磷脂酰絲氨酸外翻分析）細胞凋亡試劑盒、PBS液、胰酶消化液（北京四正佰生物科技有限公司）。主要儀器有小動物呼吸機、動物監測儀、流式細胞儀等。

1.2方法

1.2.1分組：隨機均分為4組，對照組（A組），僅穿線，不阻斷，160 min后直接取心肌標本；缺血組（B組），穿線后阻斷，160 min后取心肌標本；再灌注組（C組），穿線后阻斷缺血40 min，開放再灌注120 min后取心肌標本；尼卡地平組（D組），手術開始前30min于家兔耳緣靜脈全程泵入尼卡地平［0.2 μg/（kg·min）］，穿線后阻斷缺血40 min，再灌注120 min后取心肌標本。

1.2.2手術方法：所有家兔均經耳緣靜脈注射20%烏拉坦注射液（1 g/kg）及10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉成功后，剪出頸部及胸部兔毛，經口給予氣管插管（如家兔呼吸欠佳，給予小動物呼吸機輔助呼吸），取胸骨旁切口總切口，至劍突處約10 cm切口，游離劍突上3個肋骨，靠胸骨側剪斷劍突向上第二、三肋骨，游離相關組織，小型牽張器牽開，剪開縱行剪開心包（注意小心勿損傷胸膜）于左心耳下，心臟旋支起始處縫1針套環后收緊結扎。

1.2.3心肌細胞檢測：家兔安樂死后取左心耳結扎處下方心肌，用10%甲醛固定保存，做HE染色，切片，顯微鏡觀察心肌梗死病變情況。手術結束后根據分組情況取左心耳結扎處下方心肌（約5 g），PBS液保存。1 h內將標本經小剪刀剪碎，經PBS液沖洗3次，離心機離心去上清，0.25%的胰酶消化1 h，離心機離心取上清，加入100 μL結合緩沖液和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的Annexin V（20 μg/mL）10 μL，室溫避光30 min，再加入碘化丙錠（50 μg/mL）5 μL，避光反應5 min后，加入400 μL結合緩沖液，立即用Facscan進行流式細胞術檢測（一般不超過1 h），同時以不加Annexin V FITC及PI的一管作為陰性對照。

1.3統計學分析

2　　結果

2.1各組心肌細胞染色結果比較

結果顯示，A組心肌可見肌纖維呈束狀排列，細胞染色正常，細胞核排列基本規則；B組心肌可見失去正常肌纖維結構，細胞染色異常，水腫明顯，細胞核固縮；C組可見正常肌纖維結構消失，細胞染色異常，細胞水腫，細胞核排列不規則；D組可見間質水腫輕，細胞染色基本正常，肌纖維排列基本正常。見圖1。

圖1　　各組心肌細胞染色結果比較 ×200Fig.1　Comparison of staining results of myocardial cells in each group×200

2.2各組心肌凋亡結果比較

結果顯示，D組心肌細胞的凋亡程度低于B組和C組（P分別為0.000 4，0.000 3，），高于A組（P= 0.034 3）。心肌細胞的壞死程度D組低于B組和C組（P分別為0.000 2，0.003 8，），但與對照組比較無統計學差異（P=0.106 3，）。見圖2、表1。

圖2　　流式細胞儀檢測各組細胞凋亡及壞死結果Fig.2　Flow cytometry instrument testing each cell apoptosis and necrosis

表1　　各組細胞凋亡及壞死情況比較（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

表1　　各組細胞凋亡及壞死情況比較（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

1）P＜0.05 vs groups A，B，and C；2）P＜0.01 vs groups B and C.

Group　n　Apoptosis　Necrosis n Percentage（%）　n　Percentage（%）A 10　1 981±1 325　22.00±2.94　202±111　2.99±0.48 B 10　12 713±3 937　28.64±2.67　3 243±1 174　18.64±3.88 C 10　13 676±3 404　34.15±9.18　3 181±2 339　11.41±2.88 D 10　3 599±1 639　22.39±3.441）　295±63　3.64±0.882）

3　　討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者很多需要行冠狀動脈旁路移植術，很多高齡患者冠狀動脈病變嚴重，術前有高血壓病史，在手術麻醉誘導的時候會出現高血壓危象，導致心肌耗氧增加而發生心肌缺血，甚至出現急性心肌梗死等并發癥，導致術中及術后循環不穩，心肌酶升高等情況，從而危及患者生命。尼卡地平是術前患者用來降壓的藥物，除了降壓作用外是否還有其他改善心肌缺血的作用既往的文獻沒有報道［4］。本實驗結果顯示，D組心肌細胞的凋亡及壞死程度低于B組和C組（P＜0.01），可見尼卡地平可以減輕心肌細胞凋亡，減少心肌細胞壞死。說明術前應用尼卡地平對心肌進行缺血預適應有一定作用，一定程度上能改善心肌缺血及再灌注損傷，從而改善心臟功能。雖然在細胞凋亡D組高于A組（P＜0.01），但在心肌壞死方面2者卻無統計學差異（P＞0.05），說明尼卡地平缺血預適應后無太多壞死心肌，與以往研究［5］結果一致。

尼卡地平是一種新型L型鈣離子拮抗劑，能抑制心肌與血管平滑肌的跨膜鈣離子內流而不改變血鈣濃度，血管選擇性較強，在血管平滑肌作用勝于心肌。動物實驗中選擇性擴張冠狀血管平滑肌，此作用產生時的血藥濃度對心肌不產生負性肌力作用，對心律及心收縮力的影響極小。因而能改善冠狀動脈供血，減少心肌耗氧。研究［6-7］顯示尼卡地平分布于缺血的細胞膜，可以改善組織灌注及代謝紊亂，抑制細胞鈣內流，減輕線粒體鈣超載，恢復三磷酸腺苷生成，減輕細胞內乳酸中毒，降低細胞內pH，從而改善心肌缺氧狀態，減少心肌凋亡的發生。通過動物實驗［8］證明尼卡地平在急性心力衰竭患者中可增加心臟指數、降低全身外周血管阻力，降低肺動脈楔壓，但對心率無影響。因而對心肌凋亡及壞死有一定的抑制作用。

綜上所述，尼卡地平對心肌缺血及再灌注損傷有缺血預適應作用，可以減少缺血再灌注損傷所誘導的心肌細胞凋亡及壞死。在選擇圍手術期降壓藥物方面，尼卡地平更有優勢，今后應進一步研究冠脈橋內給予小劑量尼卡地平是否能進一步抑制心肌凋亡及壞死。

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（編輯武玉欣）

EffectsofNicardipineonApoptosisinIschemiaReperfusionMyocardiumofRabbits

HANLu，ZHANGJizhuo，CHENXinghua
（DepartmentofCardiacSurgery，BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100038，China）

ObjectiveTo investigate the effects of nicardipine on apoptosis in ischemia?reperfusion myocardium of rabbits.MethodsForty New Zealandrabbitwererandomlydividedinto4groups：controlgroup（group A），ischemiagroup（group B），ischemia?reperfusiongroup（group C），ni?cardipine treatment group（group D）.Ischemia?reperfusion model was established by left circumflex branch coronary artery ligation for 40 min，fol?lowedby120minreperfusion.Apoptoticcardiomyocytewasdetectedusingtheanalysisfortheexposureofphosphatidyl?serine（AnnexinV）meth?od.ResultsMyocardial celldamage waslower inDgroupthanthatingroupBandgroupCfrompathology（P＜0.01）.Themyocardial cellapopto?sis in group D is less than that of group B and group C（P＜0.01），but higher than that of group A（P＜0.05）.Myocardial cell necrosis is lower than group B and group C（P＜0.01），and no difference was found comparing with group A（P＞0.05）.ConclusionNicardipine horizon can reduce themyocardialcellapoptosisinrabbitswithmyocardialischemicreperfusioninjury.

apoptosis；nicardipine；ischemia?reperfusion；cardiomyocyte；anexin V

R654.2

A

0258-4646（2016）08-0746-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.018

韓露（1978-），男，主治醫師，博士. E-mail：moer031@163.com

2015-06-18
網絡出版時間：