采用單邊可調(diào)節(jié)外固定架制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型

張猛　魏俊強(qiáng)　段建偉　閆石

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采用單邊可調(diào)節(jié)外固定架制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型

張猛魏俊強(qiáng)段建偉閆石

067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷小兒骨科在讀研究生(張猛，段建偉)

【摘要】目的探討采用單邊可調(diào)節(jié)外固定器制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型的可行性。方法將72只新西蘭大白兔隨機(jī)分為15 mm缺損組、10 mm骨蠟缺損組及10 mm缺損組各24只，均行左側(cè)股骨截骨，以單邊可調(diào)節(jié)外固定架為固定裝置制成骨缺損模型。15 mm缺損組骨折斷端間隙為15 mm，不用骨蠟封堵；10 mm骨蠟缺損組骨折斷端間隙為10 mm，用骨蠟封堵髓腔；10 mm缺損組骨折斷端間隙為10 mm，不用骨蠟封堵。術(shù)后通過進(jìn)行大體觀察、X線檢查及病理組織學(xué)檢查，觀察3組股骨對位情況和截骨端的愈合情況，比較各組骨折不愈合率(制模成功率)。結(jié)果術(shù)后8周，15 mm缺損組有23只大白兔、10 mm骨蠟缺損組有22只大白兔、10 mm缺損組有23只大白兔納入統(tǒng)計。15 mm缺損組22只(95.7%)、10 mm骨蠟缺損組20只(90.9%)、10 mm缺損組10只(43.5%)的X線檢查結(jié)果符合骨折不愈合表現(xiàn)。3組骨折不愈合率總體比較的χ2=21.17，P<0.001。與10 mm缺損組比較，15 mm缺損組及10 mm骨蠟缺損組的骨折不愈合率均較高(P均<0.001)。15 mm缺損組與10 mm骨蠟缺損組間骨折不愈合率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.608)。結(jié)論采用單邊可調(diào)節(jié)外固定架制作骨折斷端間隙為15 mm以及骨折斷端間隙為10 mm且用骨蠟封堵髓腔的2種兔股骨非感染性骨折不愈合模型是可行的。

【關(guān)鍵詞】股骨；骨折，不愈合；動物模型；單邊可調(diào)節(jié)外固定架；新西蘭大白兔

眾所周知，骨折最常見的并發(fā)癥是骨折的延遲愈合及不愈合[1]。李冀等[2]的調(diào)查顯示，骨折不愈合在骨折術(shù)后并發(fā)癥中的發(fā)生率高達(dá)10%。骨折不愈合的原因不僅是最初的高能量創(chuàng)傷所致的骨與血管的損傷，骨折的治療方式也是其中之一[3]。雖然現(xiàn)在骨折的治療水平越來越高，但骨折不愈合的治療卻仍是一個棘手的難題。其中萎縮型骨折不愈合因其骨折斷端血運差，缺少成骨活性，治療更加困難[4]。近幾年出現(xiàn)的新技術(shù)——“手風(fēng)琴技術(shù)”為萎縮型骨折不愈合的治療打開了一扇新的大門[5]。由于相關(guān)的基礎(chǔ)實驗需依靠模型才能進(jìn)行，因此，對于骨折不愈合的研究，制作一種可靠的實驗動物模型勢在必行的。

目前關(guān)于利用兔股骨制作骨折不愈合模型的研究尚少。根據(jù)Schmize等的結(jié)論，造成相當(dāng)于長骨骨干直徑的1.5～2.5倍以上或其長度的1/10以上的骨缺損即可造成骨折不愈合模型[6]。Chaubey等[7]和郭樹章等[8]均利用新西蘭大白兔進(jìn)行過骨折不愈合模型的研究，證明利用兔制作該模型具有可行性。但以上所介紹的兔模型均使用兔橈骨作為造模部位，同時使用內(nèi)固定方式造模，我們則應(yīng)用較橈骨更長、直徑更大的股骨造模，因造模部位范圍的增大，造模過程的難度降低，同時，我們應(yīng)用單邊可調(diào)節(jié)外固定架對骨缺損部位進(jìn)行固定，其可通過調(diào)節(jié)兩導(dǎo)針的距離來微調(diào)骨缺損部位的距離，較內(nèi)固定方式更靈活，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

材料與方法

一、材料

選取82只4～6月齡、體質(zhì)量1.5～2.5 kg的雄性新西蘭大白兔作為骨折不愈合造模實驗動物，實驗動物由北京金牧陽實驗動物有限公司提供。所有實驗動物于清潔環(huán)境下分籠飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實驗動物中心，自由活動。所有對實驗動物的操作均符合動物倫理學(xué)要求。

二、模型制造

1. 實驗動物分組

選取10只大白兔，應(yīng)用空氣栓塞法將其處死，用電動褪毛器將其雙下肢褪毛，然后分離雙側(cè)股骨軟組織，離斷髖、膝兩關(guān)節(jié)，獲得完整的股骨標(biāo)本，對10只大白兔的股骨長度及股骨中段直徑指標(biāo)進(jìn)行測量并記錄(表1)。然后將剩余的72只大白兔隨機(jī)分為3組各24只，分別設(shè)為15 mm缺損組、10 mm骨蠟缺損組及10 mm缺損組，3組月齡及體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，P均>0.05(表2)。

表1　10只大白兔股骨標(biāo)本測量數(shù)據(jù)

注：經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，10只大白兔股骨長度及股骨中段直徑均近似于正態(tài)分布，其平均數(shù)均具有代表性

2. 非感染性骨折不愈合造模

根據(jù)文獻(xiàn)[8-10]的方法制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型。取3組大白兔左腿為實驗側(cè)，術(shù)區(qū)用電動褪毛器褪毛。術(shù)前常規(guī)肌內(nèi)注射青霉素40萬單位預(yù)防感染。使用3%戊巴比妥鈉按 1.0 mg/kg的劑量注入大白兔耳緣靜脈將其麻醉后側(cè)臥于兔臺上，保持其呼吸道通暢，用0.5%碘伏消毒褪毛區(qū)，常規(guī)鋪無菌手術(shù)單。取大腿中部外側(cè)縱形切口，逐層分離軟組織，最大程度避免損傷軟組織，于股外側(cè)肌和股后肌之間的肌間隔行鈍性分離，充分暴露股骨干。分別于股骨遠(yuǎn)端及近端平行放置2枚1.5 mm單邊可調(diào)節(jié)外固定架螺紋釘，然后安裝單邊可調(diào)節(jié)外固定架(圖1A～F)，確保其固定牢固。用線鋸在股骨中段截骨，15 mm缺損組制成15mm的骨缺損，不用骨蠟封堵；10mm骨蠟缺損組制成10 mm骨缺損，并用骨蠟封堵髓腔；10 mm缺損組制成10 mm的骨缺損，不用骨蠟封堵(圖1G～H)。于截骨過程中反復(fù)用生理鹽水沖洗截骨處，避免截骨周圍骨膜及軟組織因線鋸截骨產(chǎn)熱而受損。然后徹底止血，用生理鹽水及5%碘伏反復(fù)沖洗手術(shù)傷口后縫合、包扎。術(shù)后于清潔級環(huán)境下分籠飼養(yǎng)大白兔，肌內(nèi)注射青霉素40萬單位/日共1周，并用5%碘伏消毒傷口2次/日，常規(guī)換藥預(yù)防感染。8周后對3組行X線檢查，然后將其處死，截取骨折斷端骨痂軟組織，行蘇木素-伊紅(HE)染色，于顯微鏡下400倍視野進(jìn)行組織學(xué)觀察。

表2　15 mm缺損組、10 mm骨蠟缺損組及10 mm缺損組月齡及體質(zhì)量比較

注：3組月齡分布經(jīng)秩和檢驗得出χ2=5.352，P=0.069；3組體質(zhì)量分布經(jīng)χ2檢驗得出χ2=1.343，P=0.511

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)。分類資料用率描述，其中等級資料組間比較采用秩和檢驗，無序分類資料組間比較采用χ2檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水準(zhǔn)，α′=0.05/3。

結(jié)果

一、大體觀察

15 mm缺損組1只大白兔因麻醉意外死亡，10 mm骨蠟缺損組1只大白兔螺釘松動脫落，10 mm骨蠟缺損組及10 mm缺損組各有1只大白兔感染，均排除，即最終15 mm缺損組有23只大白兔、10 mm骨蠟缺損組有22只大白兔、10 mm缺損組有23只大白兔納入統(tǒng)計。納入統(tǒng)計的大白兔術(shù)后均可自由活動，3 d后恢復(fù)術(shù)前狀態(tài)，步態(tài)無異常(圖1I)。實驗期間，3組均正常健康生長，單邊可調(diào)節(jié)外固定架固定牢固(圖1J～L)。

二、X線檢查

術(shù)后8周，15 mm缺損組22只(95.7%)、10 mm骨蠟缺損組20只(90.9%)、10 mm缺損組10只(43.5%)的X線檢查結(jié)果符合骨折不愈合表現(xiàn)(圖1J～L)，3組骨折不愈合率總體比較的χ2=21.17，P<0.001。與10 mm缺損組比較，15 mm缺損組及10 mm骨蠟缺損組的骨折不愈合率均較高(χ2值分別為14.786及11.383，P均<0.001)，可見2組制模效果均優(yōu)于10 mm缺損組。15 mm缺損組與10 mm骨蠟缺損組間骨折不愈合比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.407，P=0.608)，可見2組的制模效果相當(dāng)。

三、病理組織學(xué)檢查

術(shù)后8周時，10 mm缺損組骨缺損區(qū)有大量的軟骨向新生骨轉(zhuǎn)化，連接骨缺損區(qū)，與自身骨組織有很好的融合。15 mm缺損組及10 mm骨蠟缺損組骨缺損區(qū)無骨性連接，由肉芽瘢痕充填，髓腔封閉(圖1M～O)。

討論

本研究結(jié)果示，以新西蘭大白兔為實驗動物時，造成相當(dāng)于長骨骨干直徑的1.5～2.5倍以上或其長度的1/10以上的骨缺損并不能完全保證制造骨折不愈合模型成功，但造成相應(yīng)倍數(shù)的骨缺損后于骨折斷端填充骨蠟或造成1.5 mm的骨缺損卻可以成功造模。

一、實驗動物的選擇

對于現(xiàn)階段的臨床治療來說，新理念或者新技術(shù)的引進(jìn)均需要經(jīng)過前期的大量基礎(chǔ)實驗來證明其療效，因此，實驗動物模型的建立必不可少。與大型動物比如犬類相比，新西蘭大白兔更容易飼養(yǎng)及控制，具有更好的實驗操作性。而且相較大型動物，新西蘭大白兔更多地被應(yīng)用于動物實驗研究，因此有統(tǒng)一的飼養(yǎng)模式。同時新西蘭大白兔的成本較大型動物低得多。就本類實驗來講，新西蘭大白兔與大鼠相比，股骨長度相對較長，手術(shù)操作性更強(qiáng)，更加容易控制骨缺損的長度，因此新西蘭大白兔非常適合作為制造骨缺損模型的實驗動物[11]。

圖1　采用單邊可調(diào)節(jié)外固定架制作兔股骨非感染性骨折不愈合模型

A：單邊可調(diào)節(jié)外固定架；B：固定術(shù)區(qū)；C：取股骨外側(cè)切口；D：充分顯露股骨；E：安裝單邊可調(diào)節(jié)外固定架；F：15 mm缺損組截骨長度(圖中標(biāo)尺最小刻度均為mm)；G：10 mm骨蠟缺損組截骨長度；H：10 mm缺損組截骨長度；I：術(shù)后自由活動的實驗動物；J：15 mm缺損組術(shù)后8周X線片；K：10 mm骨蠟缺損組術(shù)后8周X線片；L：10 mm缺損組術(shù)后8周X線片；M：15 mm缺損組術(shù)后8周病理組織學(xué)檢查圖示無骨性連接，為纖維組織(HE，×400)；N：10 mm骨蠟缺損組術(shù)后8周病理組織學(xué)檢查圖示無骨性連接，為纖維組織(HE，×400)；O：10 mm缺損組術(shù)后8周病理組織學(xué)檢查圖示軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化(HE，×400)

二、固定方式的選擇

關(guān)于造模過程中的固定方式仍值得商榷，以往的研究者們經(jīng)常采用克氏針進(jìn)行髓內(nèi)固定或者微型鋼板進(jìn)行內(nèi)固定，但這些固定方法的抗旋轉(zhuǎn)能力均差，由于實驗動物術(shù)后自由活動，過度的活動會因內(nèi)固定的抗旋轉(zhuǎn)能力差而導(dǎo)致骨折斷端旋轉(zhuǎn)微動，造成局部血運受到破壞，增加實驗的干擾因素。我們應(yīng)用的單邊可調(diào)節(jié)的固定方式具有較強(qiáng)的抗旋轉(zhuǎn)能力，可牢固固定，因此對局部血運影響不大，而且只固定局部，不影響關(guān)節(jié)，實驗動物可以自由活動。

三、造模部位的選擇

我們選用股骨作為實驗骨，因股骨較其他長骨長度更長，直徑更大，充分顯露股骨后可以提供一個較其他部位更加明顯的術(shù)野及寬敞的空間，更利于手術(shù)操作的進(jìn)行。放置單邊可調(diào)節(jié)外固定架時，應(yīng)盡量保證4根螺釘平行于一個平面內(nèi)。由于兔股骨相對于外固定架來講仍較細(xì)，因此選用1.5 mm的螺釘，避免兔股骨骨皮質(zhì)劈裂、單邊可調(diào)外固定架脫落等。

四、骨缺損長度的確定

我們是在對處死大白兔股骨測量并記錄后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析確定骨缺損長度的，兔股骨直徑分布符合正態(tài)分布，平均值為5.3 mm。根據(jù)Schmize等得出的結(jié)論，造成相當(dāng)于長骨骨干直徑1.5～2.5倍以上或其長度的1/10以上的骨缺損即可造成骨折不愈合，按此本實驗的截骨范圍為7.95 mm～13.25 mm，再參考彭吾訓(xùn)等[12]及Lin等[13]的研究，他們曾制作過兔長骨15 mm的骨缺損模型，故本實驗綜合2種結(jié)論，制作了10 mm及15 mm的骨缺損模型。筆者除了探究骨缺損長度對骨折不愈合造模的影響外，還考慮到對骨折斷端填充骨蠟后是否會對造模存在影響，故再制作了10 mm骨蠟缺損組，最后證明填充骨蠟有利于骨折不愈合模型的建立。綜上所述，15 mm組不需骨蠟填充也能成功造模，而10 mm缺損組則要用骨蠟填充才能制模成功。

綜上所述，本實驗成功建立了15 mm缺損組與10 mm骨蠟缺損組2種兔股骨非感染性骨折不愈合模型，采用單邊可調(diào)節(jié)外固定架建立這2種模型是可行的。

參考文獻(xiàn)

[1]邢丹，馬信龍，宋東輝，馬劍雄，徐衛(wèi)國，王杰，楊陽，陳陽.長骨骨折愈合力學(xué)環(huán)境的研究現(xiàn)狀. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2012, 16(6): 602-606.

[2]李冀，趙偉超，關(guān)鵬飛，王舒新，葛欣昌，焦翔，陳長河. 長骨醫(yī)源性骨不連的臨床流行病學(xué)調(diào)查. 中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志, 2012, 27(1): 34-36.

[3]Zhang M, Wang GL, Zhang HF, Hu XD, Shi XY, Li S, Lin W. Repair of segmental long bone defect in a rabbit radius nonunion model: comparison of cylindrical porous titanium and hydroxyapatite scaffolds. Artif Organs，2014, 38(6): 493-502.

[4]趙震宇，邵林，劉建宇，楊大平，郝晨光，韓劍鋒，趙洪梅，劉國鋒.微型外固定器制作大鼠股骨萎縮型骨不連模型的實驗研究. 中華創(chuàng)傷骨科雜志, 2011, 13(3): 261-264.

[5]馬忠超，王佰亮，許艷旭，王瑋瑋. 改良多功能外固定支架和交鎖髓內(nèi)釘治療脛腓骨 C 型骨折的療效對比研究. 新醫(yī)學(xué), 2014,45(10): 691-694.

[6]張鳳鳴, 閆石,張萬東. 兔股骨骨不連模型的建立. 醫(yī)學(xué)信息, 2015，28 (14)：132.

[7]Chaubey A, Grawe B, Meganck JA, Dyment N, Inzana J, Jiang X, Connolley C, Awad H, Rowe D, Kenter K, Goldstein SA, Butler D. Structural and biomechanical responses of osseous healing: a novel murine nonunion model. J Orthop Traumatol, 2013, 14(4): 247-257.

[8]郭樹章，季明華，許剛，張文舉，徐斌.兔骨折延遲愈合動物模型的建立. 實用骨科雜志, 2012, 18(3): 230-232.

[9]王永剛，裴國獻(xiàn)，張洪濤，張元平，王學(xué)明.兔股骨干缺損模型的制備及在組織工程骨實驗中的應(yīng)用. 中華創(chuàng)傷骨科雜志, 2005, 7(10): 971-974.

[10]趙震宇，邵林，劉建宇，楊大平，郝晨光，趙洪梅.外固定方法制作的大鼠股骨骨折模型. 中國組織工程研究, 2011, 15(24): 4387-4390.

[11]陳連旭，余家闊，于長隆，王海軍，恭喜，王建，謝興. 大鼠, 兔和人關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)的比較. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(41): 8230-8233.

[12]彭吾訓(xùn)，王蕾，鄧進(jìn)，李彥林，龔躍昆，李世和.一種組織工程骨修復(fù)兔股骨頭壞死模型的效果評價. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2010, 32(7): 661-664.

[13]Lin K, Liu Y, Huang H, Chen L, Wang Z, Chang J. Degradation and silicon excretion of the calcium silicate bioactive ceramics during bone regeneration using rabbit femur defect model.J Mater Sci Mater Med，2015，26(6):197.

(本文編輯：洪悅民)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.07.004

基金項目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(ZL20140067)

通訊作者，閆石，E-mail：yanshi1967@163.com

(收稿日期：2016-01-30)

Establishment of a rabbit model with non-infectious femoral nonunion by unilateral adjustable external fixator

ZhangMeng,WeiJunqiang,DuanJianwei,YanShi.

DepartmentofPediatricOrthopedicTrauma,theAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,ChinaCorrespondingauthor,YanShi,E-mail:yanshi1967@163.com

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the feasibility of establishing a rabbit model with non-infectious femoral nonunion using unilateral adjustable external fixator. MethodsSeventy two New Zealand white rabbits were randomly divided into the 15 mm defect, 10 mm bone wax defect and 10 mm defect groups (n=24 for each group). All animals underwent left femoral osteotomy. The rabbit models with osteogenic defects were established by unilateral adjustable external fixator. In the 15 mm defect group, the bone fracture space was 15 mm and bone wax was not utilized. In the 10 mm bone wax defect group, the bone fracture space was 10 mm and the medullary canal was filled with bone wax. In the 10 mm defect group, the bone fracture space was 10 mm and bone wax was not used. After the surgery, gross observation, X-ray examination and histopathological staining were performed to assess the femoral alignment and the osteotomy healing. The nonunion rate (success rate of model establishment) was statistically compared among all groups. ResultsAt postoperative 8 weeks, 23 white rabbits were included in the 15 mm defect group, 22 in the 10 mm bone wax defect group and 23 in the 10 mm defect group for statistical analysis. The X-ray findings of 22 rabbits (95.7%) in the 15 mm defect group, 20 (90.9%) in the 10 mm bone wax defect group and 10 (43.5%) in the 10 mm defect group were consistent with the characteristics of bone nonunion. The nonunion rate significantly differed among 3 groups (χ2=21.17, P<0.001). Compared with the 10 mm defect group, the nonunion rate in the 15 mm defect and 10 mm bone wax defect groups was significantly higher (both P<0.001). The nonunion rate did not significantly differ between the 15 mm defect and 10 mm bone wax defect groups (P=0.608). Conclusion It is a feasible approach to establish rabbit models with non-infectious femoral nonunion with 15 mm and 10 mm(filled with bone wax) bone fracture space by using unilateral adjustable external fixator.

【Key words】Femur; Fracture，nonunion; Animal model; Unilateral adjustable external fixator; New Zealand white rabbits