巨噬細胞誘導極化對痛風炎癥反應的影響

張夢瑩，李　志，李雪琴，鐘　民，呂　坤

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院　1.中心實驗室;2.風濕免疫科，安徽　蕪湖　241001)

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·基礎醫學·

巨噬細胞誘導極化對痛風炎癥反應的影響

張夢瑩1，李志2，李雪琴1，鐘民1，呂坤1

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院1.中心實驗室;2.風濕免疫科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：了解體外誘導極化的M1和M2型巨噬細胞對尿酸鈉結晶(MSU)誘導的急性痛風模型炎癥反應的影響。方法：選用雄性BALB/c小鼠作為實驗對象，隨機分為空白對照組、模型組、模型M1型巨噬細胞組和模型M2型巨噬細胞組。小鼠皮下氣囊注射MSU結晶誘導小鼠急性痛風模型。體外將巨噬細胞誘導極化為M1和M2型巨噬細胞，并分別注射于小鼠痛風模型皮下氣囊。于炎癥誘導后4 h、12 h和24 h檢測不同組別皮下氣囊浸潤的炎性細胞數量變化，并應用ELISA法測定囊內灌洗液中IL-1β、TGF-β的水平。結果：①在4 h、12 h和24 h時間點模型組、模型M1型巨噬細胞組和模型M2型巨噬細胞組皮下氣囊炎性細胞均高于空白對照組(P<0.01)。在4 h時間點，模型組及模型M1型巨噬細胞組和模型M2型巨噬細胞組間皮下氣囊炎性細胞數量無差異(P>0.05)；而在12 h和24 h，模型M1型巨噬細胞組皮下氣囊炎性細胞高于模型組，而模型M2型巨噬細胞組皮下氣囊炎性細胞低于模型組(P<0.05)。②在3個時間點，模型組、模型M1型巨噬細胞組及模型M2型巨噬細胞組IL-1β均高于空白對照組(P<0.01);在3個時間點比較，IL-1β水平在模型組低于模型M1型巨噬細胞組(P<0.01)，而高于模型M2型巨噬細胞組(P<0.01)。TGF-β水平在模型組高于模型M1型巨噬細胞組(P<0.01)，而低于模型M2型巨噬細胞組(P<0.01)。結論：巨噬細胞的極化在痛風炎癥反應不同階段起到不同的作用。

【關鍵詞】巨噬細胞；尿酸鈉結晶；痛風；IL-1β；TGF-β

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.004

痛風是尿酸鈉或尿酸鈉結晶(monosodium urate monohydrate crystals，MSU)從超飽和的細胞外液沉積于組織或器官引起的一組臨床綜合征。臨床表現為急性關節炎、痛風石及慢性關節炎、痛風性腎病，嚴重者可出現關節致殘、腎功能不全。近年來，隨著人們飲食結構的改變，肥胖人群增多，其發病率逐年增高，并有年輕化的趨勢。本文以鼠皮下氣囊痛風模型為研究手段，探討痛風的發作及自發緩解機制。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級雄性BALB/c 小鼠，6～8周齡，體質量(20±2)g，由南京青龍山實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0006。實驗前實驗室標準條件下常規飼養一周。

1.2藥品與試劑尿酸鈉(sigma 公司)；IL-1β和TGF-β ELISA試劑盒(美國RB公司)；DMEM 和RPMI1640培養液(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶(碧云天公司)；LPS、IFN-γ、IL-4(Peprotech公司)；APC 標記的抗小鼠CD206 抗體(BD公司)，APC 標記的抗小鼠INOS抗體(Ebioscience公司) 。

1.3實驗方法

1.3.1尿酸鈉結晶的制備無菌條件下將6 mL 1 mol/L NaOH 溶液、1 g 尿酸鈉加入194 mL蒸餾水混合并煮沸，經攪拌使尿酸充分溶解，自然降溫，滴入1 mol/L的HCl調pH 值為7.0，溶液呈乳白色后立即離心，4 ℃冷卻1 h后離心收集結晶，置于180 ℃干燥箱烘2 h，低溫干燥。臨用前將尿酸鈉結晶100 mg，加9.9 mL PBS和0.1 mL 吐溫20，制備成10 mg/mL無菌尿酸鈉溶液。

1.3.2小鼠骨髓來源的巨噬細胞極化及鑒定將小鼠頸椎脫臼處死后，無菌分離股骨和脛骨，用無菌1 mL注射器吸入L929條件DMEM培養基(含有20%小鼠成纖維細胞株L929培養3天的上清、20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，1 mL無菌注射器吸取培養基吹下骨髓內容物入一無菌培養皿，并將細胞充分吹勻，接種于6孔細胞培養板中。在L929條件培養基中培養，7 d后去除非貼壁細胞，再培養于完全RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、1000 U/mL青霉素、100 U /mL鏈霉素)中，1天后貼壁細胞即為骨髓來源的巨噬細胞。第8天后吸取上清以PBS洗滌2遍，再加入新的DMEM完全培養基，根據實驗要求以IFN-γ(100 U/mL) 和LPS(100 ng/mL)共同刺激培養48 h，誘導出M1型巨噬細胞；以IL-4 (20 ng/mL) 刺激培養48 h誘導出M2型巨噬細胞。48 h后消化收集細胞進行流式細胞儀檢測。同時收集細胞，用Trizol 提取總RNA，行實時定量PCR檢測M1型、M2型特異基因。qPCR反應步驟如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸34 s，共進行40個循環。同一樣本3復孔，以GAPDH作為內參照。實驗結果以熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動進行分析。其相對定量值使用比較Ct法進行計算，計算公式為2-ΔΔCt。

1.3.3小鼠皮下氣囊急性痛風模型、分組及用藥將小鼠隨機分組，即空白對照組、模型組、模型M1和M2型巨噬細胞共4組，各組每個時間點6只。小鼠第1天背部皮下注射滅菌過濾空氣5 mL,形成適當大小的氣囊,隨后每天注入3 mL 空氣,使膨脹3天，第7 天皮下氣囊注射200 μL的MSU 10 mg/mL，即可誘導急性痛風炎癥模型。空白對照組氣囊注射200 μL的PBS。其中同時，模型M1、M2型巨噬細胞組分別注射5×107/mL的M1、M2型巨噬細胞100 μL；空白對照組、模型組給予相應體積的PBS。

1.4檢測MSU誘導的急性痛風模型氣囊中炎性細胞和促炎癥因子各組小鼠誘導炎癥4 h、12 h和24 h時間點，向皮下氣囊注射2 mL PBS沖洗，按摩5 min，抽出灌洗液裝于5 mL的離心管中，1500 r/min離心5 min，上清液分裝于EP管中，于 -80 ℃冰箱保存待測，采用 ELISA 法檢測沖洗液中IL-1β和TGF-β的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。且管底細胞進行炎性細胞計數。

2結果

2.1對極化后的巨噬細胞行流式檢測巨噬細胞膜蛋白表達的差異是鑒定不同類型巨噬細胞的重要方法。刺激細胞48 h 后，對已報道的M1型巨噬細胞的標志NOS2和M2型巨噬細胞的標志CD206的表達進行了流式檢測(圖1) 。

圖1流式檢測體外極化的巨噬細胞相關標志的表達

2.2實時定量PCR檢測相關基因的mRNA表達刺激48 h后，用Trizol 提取消化細胞，提取總RNA，目的是對M1型和M2型巨噬細胞特征性的基因表達進行檢測。發現經過體外誘導刺激之后，M1型和M2型特征性的相應標志的表達有著明顯的升高(圖2) 。經流式細胞儀及實時定量PCR檢測，證實體外誘導巨噬細胞M1和M2型巨噬細胞極化成功。

**P<0.01,***P<0.01,M1vs. M2。

圖2qPCR檢測刺激后巨噬細胞極化相關基因的表達

2.3巨噬細胞對尿酸鈉誘導的小鼠急性痛風模型炎性細胞數量的影響MSU結晶注入后在4 h、12 h和24 h時間點模型組、模型M1型巨噬細胞組和模型M2型巨噬細胞組皮下氣囊炎性細胞均高于空白對照組。4 h時間點，4組比較差異有統計學意義，進一步兩兩比較發現，各模型組與空白對照組間差異有統計學意義，3個模型組之間差異無統計學意義(P>0.05)。而在12 h和24 h時間點，模型M1型巨噬細胞組皮下氣囊炎性細胞高于模型組，而模型M2型巨噬細胞組低于模型組。見表1。

2.4巨噬細胞對尿酸鈉誘導的小鼠急性痛風模型炎癥因子的影響于4 h、12 h和24 h時間點檢測各組皮下氣囊灌洗液中IL-1β和TGF-β水平。結果在3個時間點模型組、模型M1型巨噬細胞組及M2型巨噬細胞組IL-1β均高于空白對照組;在3個時間點比較，模型M1型巨噬細胞組IL-1β水平高于模型組，而模型M2型巨噬細胞組IL-1β水平低于模型組。3個時間點的TGF-β水平在模型M1型巨噬細胞組低于模型組，而模型M2型巨噬細胞組高于模型組。見表2。

組別n0h4h12h24h空白對照組6-2.81±0.903.48±0.861.26±0.18模型組6-17.80±3.2219.82±1.207.98±2.85模型M1型巨噬細胞組6-18.14±4.1626.64±2.03a18.48±3.28a模型M2型巨噬細胞組6-16.62±3.488.53±3.12a4.32±2.27aF31.62169.0256.91P<0.01<0.01<0.01

a與相應時間點模型對照組比較P<0.05。

表2各組小鼠氣囊灌洗液中IL-1β、和TGF-β水平表達(n=6)

組別IL-1β/(pg/mL)TGF-β/(pg/mL)4h12h24h4h12h24h空白對照組30.45±4.3828.23±3.5627.82±3.7626.34±2.4728.32±5.6327.48±3.42模型組140.65±8.1296.91±9.4746.33±4.3232.92±3.1057.27±6.0438.39±5.13模型M1型巨噬細胞組250.68±10.75b213.37±6.75b87.69±7.86b4.02±0.58b36.79±5.03b24.62±4.32b模型M2型巨噬細胞組82.43±9.48b56.64±7.14b32.95±5.43b69.75±3.42b86.38±4.52b49.04±3.47bF754.52814.73141.85600.32137.8343.15P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

b與相應時間點模型對照組比較P<0.01。

3討論

近年來的體外研究提示單核巨噬細胞在單尿酸鈉觸發的初始炎癥反應中起到核心作用。單核細胞在單尿酸鈉結晶刺激下產生一系列促炎癥因子，尤其是IL-1β[1-2]，一直以來被認為是痛風和單尿酸鈉結晶誘導的炎癥中的核心細胞因子[3-4]。在鼠的痛風模型中，當鼠敲除IL-1受體或注射IL-1阻滯劑rilonacept(列洛西普)后，單尿酸鈉注入踝關節腔引起的炎癥均顯著下降[5-6]。給急性痛風患者注射抗IL-1因子拮抗劑，IL-1受體抗體(阿那白滯素)、IL-lβ抗體等均取得明顯療效，從而進一步證實IL-1β在痛風發病機制中的核心作用[7-8]。本文在不同實驗組測IL-1β水平，旨在判斷不同干預因素下痛風炎癥發作程度的差異。

痛風性炎癥的自限性從希波克拉底時代開始得到認識，并得到近代實驗室研究的支持[9]。急性痛風短期內治療的顯著功效也提示明顯的內源性機制限制了炎癥的發展。研究發現TGF-β在痛風的自發緩解中起到重要作用[10]。越來越多的證據提示單核巨噬細胞系統不僅在痛風炎癥啟動中而且在炎癥進展及緩解中均起到軸心作用。體外研究提示，單尿酸鈉結晶刺激可使分離的單核細胞由分泌促炎因子的M1型巨噬細胞轉化成分泌抗炎因子TGF-β的M2型巨噬細胞[11]，該研究提示單核細胞可驅動炎癥，而極化的巨噬細胞可緩解痛風炎癥。然而其他研究顯示單尿酸鈉結晶在原位和骨髓誘導巨噬細胞均起到促炎癥作用，而且巨噬細胞在啟動炎癥級聯反應中起關鍵作用[12-13]。故單尿酸鈉結晶體內募集的單核巨噬細胞群的真正功能表型仍有爭議，甚至是相反的結論。大量證據表明單核巨噬細胞系統可因局部環境變化而表達不同的功能活性[14]。有研究提示單尿酸鈉結晶在鼠的腹腔痛風模型中可募集單核細胞極化為具有促炎癥反應的M1樣巨噬細胞[15]。而M2型巨噬細胞在痛風的炎癥反應中至今尚未見報道。本文的研究關鍵點在于，巨噬細胞不同的表型是否起到不同作用并參與了痛風炎癥的發作與自發緩解。我們將小鼠骨髓來源的巨噬細胞進行體外誘導極化為M1和M2型巨噬細胞，分別注入單尿酸鈉誘導的痛風皮下氣囊模型中，檢測不同組促炎癥因子IL-1β和抗炎因子TGF-β的水平。我們的研究提示M1型巨噬細胞注射入單尿酸鈉誘導痛風模型，促使IL-1β水平升高，M1型巨噬細胞有促進痛風炎癥進展持續的作用。而M2型巨噬細胞注射入單尿酸鈉誘導痛風模型中，表現為IL-1β水平降低，而TGF-β水平升高，提示M2型巨噬細胞有拮抗痛風炎癥，促進炎癥緩解的作用。動物痛風模型并不能等同于人類痛風炎癥狀態，但巨噬細胞的極化可能在痛風發生及緩解中起到一定的作用，為痛風的治療提供一種思路。

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文章編號：1002-0217(2016)04-0320-04

基金項目：皖南醫學院中青年科研基金項目(WK2013F07)

收稿日期：2015-11-04

作者簡介：張夢瑩(1983-)，女，檢驗師，(電話)13955356393，(電子信箱)51591569@qq.com.

【文獻標識碼】【中圖號】R 589.7A

Effects of differentiated macrophages on gouty inflammation

ZHANG Mengying,LI Zhi,LI Xueqin,ZHONG Min，LYU Kun

Central Laboratory,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To observe the effects of polarized M1 and M2 macrophages in vitro on monosodium urate (MSU) crystals-induced acute gouty inflammation.Methods:Male BALB/c mice,selected as experimental models,were randomly divided into group of blank control,models,M1 macrophages and M2 macrophages.Acute mouse gouty inflammation model was developed by subcutaneous injection of MSU crystals.M1 and M2 macrophages were polarized in vitro and injected into subcutaneous air sacs of gouty inflammation model.The levels of IL-1β and TGF-β in subcutaneous air sacs were dynamicaly detected by ELISA before and after infusion of macrophages.Results:①The number of infiltrate inflammatory cells from model group,M1 macrophage group and M2 macrophage group was significantly increased compared to the blank controls at 4 h,12 h,and 24 h(P<0.01),whereas remained no difference at 4 h among groups of models,M1 macrophages an M2 macrophages(P>0.05).However,the number of inflammatory cells of model group was significant lower than that of M1 macrophages group,but significant higher than that of M2 macrophages group at 12 h and 24 h after stimulation(P<0.05);②IL-1β level in model group and groups of M1 macrophages and M2 macrophages was higher than that of control group at 3 time points(P<0.01).IL-1β level in model group was lower than that of M2 macrophages group,yet higher than that of M1 macrophages group(P<0.01).Model group had higher TGF-β level than M1 macrophages group,but lower level than M2 macrophages group.Conclusion:Differentiation of macrophages may diversely function in the conversion of inflammation of the gout.

【Key words】macrophage;monosodium urate crystals;gout;IL-1β;TGF-β