NLRP3在鼻咽癌中的表達及其臨床意義

湯俊照，汪亦品

(1.宣城市中心醫院　五官科，安徽　宣城　242000；2.南京醫科大學　病理學與病理生理學系，江蘇　南京　210029)

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·臨床醫學·

NLRP3在鼻咽癌中的表達及其臨床意義

湯俊照1，汪亦品2

(1.宣城市中心醫院五官科，安徽宣城242000；2.南京醫科大學病理學與病理生理學系，江蘇南京210029)

【摘要】目的：探討炎癥小體NLRP3在鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織中的表達水平變化及其與患者臨床預后的關系。方法：采用實時定量PCR和免疫組化檢測40例鼻咽癌組織和12例正常鼻咽黏膜組織中NLRP3的表達水平。結果：①NLRP3在鼻咽癌組織中表達顯著高于正常鼻咽黏膜組織 (P<0.05)；②在鼻咽癌患者中，NLRP3的表達水平與腫瘤的淋巴結轉移以及患者的臨床預后有關(P<0.05)，NLRP3高表達患者較低表達患者具有更好的局部無復發生存率和無瘤生存率，但與年齡和組織病理類型無明顯相關關系(P>0.05)。結論：NLRP3具有提示鼻咽癌腫瘤轉移及判斷患者預后的價值。

【關鍵詞】NLRP3；腫瘤轉移；鼻咽癌；LRSF/DSF

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.021

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種侵襲性強的惡性腫瘤，惡性程度高，早期易發生淋巴結和全身遠處轉移，具有相當高的病死率，但其發生發展的機制目前尚不是很清楚[1]。

近年來，炎癥-腫瘤的相關研究已成為腫瘤學研究重點，流行病學已證實至少25% 的人類惡性腫瘤與炎癥和慢性感染有關[2]。研究發現，致炎因子水平升高與卵巢癌、頭面部鱗狀細胞癌、乳腺癌等各種腫瘤密切相關[3-6]。鑒于此,本研究采用實時定量PCR和免疫組化技術檢測40例鼻咽癌組織和12例正常鼻咽黏膜組織中NLRP3的表達水平，旨在探討NLRP3的表達水平與鼻咽癌之間的關系。

1資料與方法

1.1臨床資料收集宣城市中心醫院病理科2000年10月～2010年7月外科手術切除和存檔的鼻咽癌組織40例，所有標本均常規經10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。40例患者中，男28例，女10例；年齡23～62歲，中位年齡43歲。按福州會議[7]進行臨床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期13例、Ⅲ期16例、Ⅳ期6例；復發22例，無復發18例；中位隨訪時間60.5月，隨訪期間死亡6例。所有病例病理活檢前均未行任何治療。對照組12例正常鼻咽黏膜組織來自我院同期體檢病例。52例中7例組織進行實時定量PCR檢測。

1.2免疫組織化學染色 采用免疫組化染色SP法，按試劑盒操作步驟進行染色。NLRP3兔抗人多克隆抗體購自北京博鰲森生物技術公司，稀釋度1∶50；SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自杭州碧云天生物技術公司。光鏡下腫瘤細胞出現棕黃色著色者判定為陽性，并用0、1、2和3分別代表陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性。蛋白表達量由陽性信號著色強度的量化得分進行判定，其中弱陽性代表低表達，中等陽性、強陽性代表高表達。

1.3實時定量PCR采用Primer 3.0在線設計來設計實時定量PCR引物，遵循跨內含子的原則，以避免非特異性及引物二聚體產生，委托上海Invitrogen公司合成(見表1)。

表1PCR引物序列

名稱引物序列GAPDHF:5'-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3'R:5'-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3NLRP3F:5'-GTGGTGACCCTCTGTGAGGT-3'R:5'-TCTTCCTGGAGCGCTTCTAA-3'

采用TRIZOL一步法抽提細胞及組織的總RNA，取1 μg總RNA 進行逆轉錄反應，采用SYBR green 實時定量PCR方法，反應體系為25 μL，置于ABI PRISM 7500熒光定量PCR 儀中進行PCR 擴增，反應條件為95 ℃，10 min；隨后以95 ℃，15 s 和60 ℃，1 min循環40次。 采用參照基因的 Ct 法計算目的基因mRNA 的相對表達量，采用相對定量法計算各基因mRNA 表達水平。

1.4統計學方法 使用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。臨床病理類型采用Fisher精確概率法檢驗，生存曲線使用Kaplan-Meier 法進行繪制，兩組間比較用t檢驗；Cox危險因素模型用多因素方差分析法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1炎癥小體NLRP3在鼻咽癌組織中表達升高免疫組化顯示NLRP3主要表達于細胞質內，偶見于細胞核(圖1A、B)。NLRP3在鼻咽癌組織中陽性表達明顯高于正常鼻咽黏膜組織(升高近6倍)，差異有統計學意義(P<0.01)。同樣，實時定量PCR顯示鼻咽癌組織中NLRP3表達量較正常組織升高近4倍，差異具有統計學意義(P<0.01)。

A：NLRP3在NPC和正常組織中的表達；上圖為代表性免疫組化圖片，下圖為免疫組化陽性評分。B：實時定量PCR法檢測鼻咽癌和正常鼻黏膜組織中NLRP3的表達(*P<0.05,n=7)。

圖1NLRP3在鼻咽癌組織中的表達

2.2鼻咽癌組織中NLRP3的表達與預后的關系Kaplan-Meier生存曲線顯示腫瘤組織中NLRP3高表達患者較低表達患者具有更好的局部無復發生存率(local recurrence-free survival,LRFS)和無瘤生存率(disease-free survival，DFS)，差異具有統計學意義(P<0.05，圖2A、B)。

2.3鼻咽癌組織中NLRP3表達水平與各臨床參數之間的關系鼻咽癌組織中NLRP3的表達水平與腫瘤臨床病理類型、患者年齡無明顯相關性，而和腫瘤的淋巴結轉移有關(P<0.05，表2)。

表2鼻咽癌組織中NLRP3表達水平與各臨床參數的關系

類別例數NLRP3表達水平高低P年齡/歲0.751 ≤45221012 >4518108組織類型1.000 基底樣細胞鱗癌734 未角化癌331716淋巴結轉移<0.001 有16142 無24618

A：Kaplan-Meier 生存曲線分析鼻咽癌患者腫瘤組織中炎癥小體NLRP3的表達水平高低與患者LRFS之間的關系。 B：Kaplan-Meier生存曲線分析鼻咽癌患者腫瘤組織中炎癥小體NLRP3的表達水平高低與患者DFS之間的關系。

圖2鼻咽癌組織中NLRP3表達水平高低與LRFS和DFS的關系

3討論

炎癥是機體受到多種體內外因素刺激后產生的局部或全身性應答反應，也是機體針對腫瘤免疫應答和損傷修復的重要機制。許多研究表明，炎癥細胞及其因子在腫瘤的發生發展和免疫逃逸等方面的促進作用遠大于其本身的抗腫瘤效應，對炎癥-腫瘤相互關系的研究是人類惡性腫瘤研究中十分重要的環節[8]。

炎癥小體是一種細胞內大分子量的多蛋白復合體，由類型識別受體(如NLRP3、NLRC4、AIM2等)、接頭蛋白ASC及caspase-1組成[9]，是天然免疫系統的重要組成部分。炎癥小體能識別病原相關分子模式(PAMPs)[10]或者宿主來源的危險信號分子(DAMPs)[11]。炎性小體能夠調節半胱天冬肽酶-1(caspase-1)的活化進而在天然免疫防御的過程中促進細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，發揮生物學效應[12-13]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)是最具代表性的炎癥小體。NLRP3炎癥小體在很多疾病中都發揮重要作用。Zhou等發現高濃度的葡萄糖能刺激胰島細胞激活 NLRP3炎癥小體,產生 IL-1β，引發炎癥反應[14]。在腫瘤研究中，人們發現，NLRP3通過剪切糖皮質激素受體而誘導急性白血病(ALL)的糖皮質激素抵抗[15]。而在結腸癌[16]、膠質瘤[17]中，NLRP3炎癥小體可抑制腫瘤的遷移及增值，表現出了組織差異性。

目前NLRP3在鼻咽癌中的角色尚不十分清楚。本研究通過對40例有臨床隨訪資料的NPC患者進行分析，NLRP3在腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常組織，表明NLRP3可能參與了NPC腫瘤的發生。我們知道，NPC治療的最大障礙是腫瘤極易發生淋巴結轉移，導致患者預后普遍較差。預防、預測并抑制NPC的轉移對改善NPC患者的生存率無疑是非常關鍵的。而目前NLRP3與NPC淋巴結轉移之間的關系卻不清楚。本研究中，我們通過對NLRP3的表達與鼻咽癌患者臨床各參數之間的統計學結果進行分析，發現淋巴結轉移患者腫瘤組織中NLRP3的表達顯著低于無轉移的患者。同時我們也發現鼻咽癌組織中炎癥小體蛋白NLRP3表達水平高低與患者的LRSF和DSF具有明顯的相關性，NLRP3越高，LRSF和DSF越好，提示NLRP3參與了腫瘤的進展過程，在局部腫瘤組織中過表達炎癥小體NLRP3可能起到控制腫瘤的作用。但NLRP3的水平高低卻與患者年齡和腫瘤的病理類型無明顯相關性。綜上所述，本研究發現了NLRP3可能在NPC腫瘤的進展中發揮重要作用，可作為獨立的良好預后分子標志物，為腫瘤提供有效的治療靶點。

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文章編號：1002-0217(2016)04-0374-04

收稿日期：2015-11-22

作者簡介：湯俊照(1981-)，男，住院醫師，(電話)18956308352，(電子信箱)285127072@qq.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 739.63A

NLRP3 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

TANG Junzhao,WANG Yipin

Department of ENT,Xuancheng Central Hospital,Xuancheng 242000,China

【Abstract】Objective：To determine the expression level change of inflammasome NLRP3 in tissues of nasopharyngeal carcinoma(NPC) and normal nasopharyngeal mucosa,and investigate the level change with clinical prognosis.Methods:Real-time quantitative PCR and immunohistochemistry techinqe were used to detect NLRP3 expression level in 40 patients with NPC and in 12 subjects with normal nasopharyngeal mucosa.Results:①The NLRP3 expression was significantly higher in NPC tissue than that in normal nasopharyngeal mucosa(P<0.05);②Expression level of NLRP3 was correlated with lymph node metastasis of the tumor and clinical prognosis in patients with nasopharyngeal cancer(P<0.05).Although patients with higher NLRP3 expression level had better local recurrence-free survival (LRFS) and disease-free survival (DFS),yet NLRP3 level had no obvious correlation with patients′ age and histopathologic types of tumor (P<0.05).Conclusion:Inflammasome NLRP3 is better indicative of tumor metastasis and prognosis for patients of NPC,and higher NLRP3 level may lead to better prognosis.

【Key words】NLRP3;neoplasm metastasis;nasopharyngeal carcinoma;LRSF/DSF

汪亦品，女，實驗師，(電子信箱)yipin698@163.com，通信作者.