斑節對蝦泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表達分析

傅明駿，吳 松，唐 蕾，周發林，邱麗華，江世貴

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所/農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發中心，海南 三亞 572028；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；4.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

斑節對蝦泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表達分析

傅明駿1，2，吳 松1，3，唐 蕾1，4，周發林1，邱麗華1，江世貴1

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所/農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發中心，海南 三亞 572028；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；4.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

傅明駿，吳松，唐蕾，等.斑節對蝦泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表達分析［J］.廣東農業科學，2016，43（4）：144-150.

從斑節對蝦（Penaeus monodon）肝胰腺轉錄組數據中篩選獲得泛素融合蛋白UbL40基因（ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein，PmUbL40）的部分序列，利用RACE技術克隆其cDNA全長序列，通過生物信息學進行結構分析；利用實時定量PCR技術檢測該基因在斑節對蝦不同組織及卵巢不同發育期的表達情況。結果表明，PmUbL40基因cDNA全長571 bp，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）長390 bp，編碼129個氨基酸，預測分子量約14.7 ku，理論等電點為9.76。預測氨基酸序列的N-末端（1～76aa）為高度保守的泛素結構域，C-末端（77～129aa）為典型的核糖體蛋白L40結構域。多重序列比對表明不同物種的UbL40在進化過程中高度保守。實時定量PCR結果顯示PmUbL40基因在肝胰腺的表達量最高，肌肉、卵巢次之，其他組織的表達較低；在卵巢發育過程中PmUbL40基因在II期表達最高，其次是V期，顯著高于I、III、IV期。研究結果表明PmUbL40基因在斑節對蝦卵巢發育過程中可能具有重要作用。

斑節對蝦；泛素融合蛋白L40；卵巢發育；基因克隆

泛素-蛋白酶體途徑（UPP）是生物體內一種ATP依賴性的蛋白降解途徑，由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）、泛素-蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligases，E3s）、26 S蛋白酶體等組成，通過級聯反應降解蛋白，是一種重要的蛋白降解方式。UPP途徑在機體的許多生理功能中起重要作用，如細胞周期調控、細胞凋亡、轉錄調控、信號轉導、DNA 損傷和修復和免疫應答等［1-4］。研究表明，UPP 途徑參與雄性生殖系統的精子發生、精子成熟和受精等生理活動，同時在雌性的妊娠早期和正常月經周期子宮內膜的組織重建、卵母細胞減數分裂成熟和早期胚胎發育、甾體激素受體的代謝等生理活動中均具有重要作用［5-6］。在配子發生這個復雜的生理過程中，尤其是減數分裂和配子成熟，UPP途徑參與了蛋白的降解來確保整個生理過程有序進行。泛素Ub在卵母細胞第一次減數次分裂和第二次減數分裂過程中，參與細胞周期蛋白及其他細胞蛋白的降解［6-7］；在性腺發育及配子的發生過程中具有重要作用。Ub是真核生物廣泛存的一種球狀蛋白，僅由76個氨基酸組成，通過標記目標蛋白進入蛋白酶體后被特異性降解。泛素基因可分為兩類，一種是以重復基因首尾相連方式形成的聚泛素基因，編碼多聚泛素后被特異的水解酶水解成單個泛素蛋白；另一種是泛素單體和核糖體形成的融合蛋白，在泛素C末端連接52個或76～81個氨基酸延伸部分，52個氨基酸是核糖體60S亞基組分，與核糖體L40有很高的同源性；76～81個氨基酸是核糖體40S亞基的組分，與核糖體S27具有很高的同源性。這兩種蛋白被稱為泛素融合蛋白L40 （UbL40）或泛素融合蛋白S27（UbS27）［8］。

斑節對蝦（Penaeus monodon）作為世界上最主要的對蝦養殖品種之一，因其高營養價值和經濟價值備受人們關注。斑節對蝦在卵巢組織學、性成熟指數（GSI）、卵細胞直徑、卵核的大小和形狀、核仁的形態和分布、不同發育階段卵細胞數量比例等方面將其卵巢周期劃分為6個時期，即卵原細胞期（Ⅰ）、卵母細胞減數分裂前期的前卵黃生成期（Ⅱ）、初級卵黃生成期（Ⅲ）、次級卵黃生成期（Ⅳ）、成熟期（Ⅴ）和產后期（Ⅵ）［9-10］。目前，在人工調控斑節對蝦性腺發育方面主要依賴于切除眼柄來誘導卵巢發育。但是切除眼柄技術仍然存在許多問題，親蝦對病害易感，死亡率升高，眼柄切除親蝦產的卵孵化率不高或延遲，對后代產量產生影響。因此，從分子水平認識斑節對蝦卵巢發育的作用機制，探討其卵巢發育調控機理，指導發展新的人工催熟技術，是當前研究的重點。本研究通過研究泛素融合蛋白UbL40基因（PmUbL40）克隆分析及其在斑節對蝦各組織和卵巢發育過程中的表達情況，為進一步探明斑節對蝦卵巢的分子發育機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 斑節對蝦 從海南三亞海域收集不同發育階段的雌性斑節對蝦并暫養3 d。通過觀察斑節對蝦的顏色、外部形態和性腺顏色來初步確定對蝦的發育階段期，斑節對蝦不同發育期各3只取卵巢組織后立即液氮凍存，部分卵巢組織用 4%多聚甲醛保存用于切片制作已確認卵巢發育時期分期［10］。

1.1.2 主要試劑 RNAlater、Trizol（Life Technologies公司），PrimeScriptRTReagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒、pMD18-T 載體、ExTaq酶、SYBR?Premix EX TaqTM（Perfect Real Time） 試劑盒、SMARTTMRACE cDNA kit（TaKaRa 公司）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（上海生工公司）。

1.1.3 引物 根據從斑節對蝦轉錄組數據中得到的PmUbL40基因片段，設計特異性引物，PmUbL40基因RACE引物（3'Race-F1：GGCTCAATTACACCACCACGCAG和3' Race-F2：TGCAGTTGTACTTTTCAGCCAAA AGC），PmUbL40基因開放閱讀框驗證引物（PmUbL40-F：TGTTTTGGGAAGAGGGAT和PmUbL40-R：CAAGACATTTAATACATGGTCC）；并設計PmUbL40基因定量引物（PmUbL40-qF：TTTGGCTGAAAAGTACAACTGCA和PmUbL40-qR：AGCTTCTTCTTGGGTCGGAT）和 E F 1 α 基因定量引物（E F 1 α-q F：TTCCGACTCCAAGAACGACC和EF1α-qR：GAGCAGTGTGGCAATCAAGC）

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 根據Trizol說明書提取斑節對蝦各組織（腦神經、胸神經、血淋巴、肌肉、腸道、心臟、肝胰腺和卵巢）及不同發育時期的卵巢組織總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，核酸微量定量儀NanoDrop-2000檢測A260/A280比值和濃度，按cDNA合成試劑盒說明進行反轉錄，反轉錄產物-20℃保存備用。

1.2.2 SMART-RACE克隆基因cDNA全長 根據實驗室已有的轉錄組數據篩選出目的PmUbL40基因片段，運用SMART-RACE方法，擴增得到PmUbL40基因cDNA序列全長。然后通過OFR Finder找的可能開放閱讀框（OFR），并用開放閱讀框驗證引物擴增驗證確定該基因OFR的正確性。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI數據庫中的Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、OFR Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）等在線軟件對測序結果進行分析，驗證該目的基因并將其拼接得到該基因的全長cDNA序列；SingnalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）查找可能的信號肽序列；使用（http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html）預測基因的等電點及分子量；使用 NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點；使用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）預測其蛋白結構域；使用 PSORT II Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進行細胞定位的預測；利用MatGAT2.02（http：//ww3.bergen.edu/faculty/jsmalley/matgat.html）進行序列相似性和一致性分析；利用BioEdit（http：//www.mbio.ncsu.edu/bioedit/）軟件進行多重比對；利用Mega5.0 軟件（http：//www.megasoftware.net/）中的鄰位相連法（Neighbor-joining）構建系統進化樹（Bootstrap=1 000）。

1.2.4 PmUbLL40基因在各組織及卵巢不同發育時期的表達分析 根據cDNA全長序列設計實時熒光定量PCR引物PmUbL40-qF和PmUbL40-qR及內參引物EF1α-qF和EF1α-qR。Real time-PCR的反應體系為：20 μL體系中含10 μL SYBR Green I Real time PCR mix，10 μmol/L的引物F和引物R 各0.4 μL，2 μL cDNA第一鏈，用滅菌水補足，每個樣品cDNA及內參分別做3個重復。反應條件為95℃ 1 min；95℃ 15 s、60℃ 1 min，45個循環。檢測PmUbL40和EF1α基因的溶解曲線和擴增曲線。根據儀器分析得出各個樣品的CT值，通過計算獲得每個樣品的RQ值即 2-△△CT，其中△CT=各樣品目的基因的 CT值-內參基因Ef1α的 CT值，△△CT=每一個樣品的△CT值-基準樣品的△CT值，基因表達水平由 RQ平均值±標準差（mean±SD）來表示，SPSS 18.0軟件對數據進行樣本單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 PmUbL40基因全長及cDNA序列分析

根據已知的斑節對蝦肝胰腺轉錄組序列，利用RACE克隆得到斑節對蝦PmUbL40基因cDNA全長序列571 bp（GenBank登錄號：KP641180），包括50 bp的5'UTR、131 bp的3'UTR，開放閱讀框（ORF）為390 bp，編碼129個氨基酸（圖1），預測蛋白的相對分子質量為14.7 ku，等電點為9.76。SingnalP分析其預測氨基酸序列不含有信號肽序列。使用SMART預測氨基酸序列的氮末端（1～76aa）為高度保守的泛素結構域，碳末端（77～129aa）為典型的核糖體蛋白L40結構域。NetPhos 2.0 Server對其氨基酸序列進行分析得到以下可能的磷酸化位點：1個蘇氨酸磷酸化位點（T22），2個絲氨酸磷酸化位點（S57和S108），1個酪氨酸磷酸化位點（Y89）。PSORT Ⅱ預測結果顯示其細胞定位在細胞核內（60.9%）。核糖體蛋白L40結構域中含有4個半胱氨酸殘基（C96、C99、C110、C115）構成1個C2-C2型鋅指結構，1個核定位序列（109NCRKKKCGH117）。

2.3 PmUbL40與其他物種UbL40序列比對及系統進化樹分析

利用MatGAT2.02將 PmUbL40的蛋白序列與GenBank數據庫中其他物種的蛋白序列進行序列相似性和一致性分析，并用Bioedit進行多重序列比對，結果（圖2）顯示，PmUbL40在物種進化中高度保守，斑節對蝦與凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei，GenBank登錄號：AIJ28479）的UbL40蛋白序列相似性和一致性均達100%。

利用MEGA5.0軟件構建PmUbL40和其他物種 U b的系統進化樹，結果（圖3）表明，PmUbL40與凡納濱對蝦、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，ADF45323）、豐年蝦（Artemia franciscana，ABS19964）聚為一支，親緣關系較近；脊椎動物人類（Homo sapiens，NP_003324）、牦牛（Bos mutus，ELR54587）、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001187064）、鯉魚（Cyprinus carpio，ABS32204）、斑馬魚（Danio rerio，NP_001032190）和大西洋鮭（Salmo salar，ACN09942）聚為一支；軟體動物牡蠣（Crassostrea gigas，EKC19428）、光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata，AAG49552）聚為一支；海參（Holothuria glaberrima，AEB53190）和鹿角珊瑚（Acropora millepora，AAC47388）聚為一支。

圖1 PmUbL40全長 cDNA 序列及其推導的氨基酸序列

圖2 斑節對蝦PmUbL40與其他物種的Ub蛋白氨基酸序列比對

圖3 PmUbL40與其他物種UbL40氨基酸序列系統進化樹

2.4 PmUbL40基因在不同組織中的表達

利用實時熒光定量PCR檢測PmUbL40在不同組織中的表達情況，結果（圖4）顯示，PmUbL40在各組織中肝胰腺表達量最高，其次為肌肉和卵巢，其中肝胰腺與其他個組織表達差異顯著。

圖4 PmUbL40基因在不同組織中的表達

2.5 PmUbL40基因在卵巢不同發育時期的表達

斑節對蝦卵巢發育各期中，PmUbL40在卵巢Ⅱ期的表達量最高，顯著高于其他期卵巢；其次為Ⅴ期，顯著高于卵巢I、III、IV期的表達量（圖5）。

圖5 PmUbL40基因在卵巢不同發育時期的表達

3 　討論

UPP途徑是生物體內重要的蛋白降解途徑，是一個復雜、嚴密調控的過程，由Ub、E1、E2s、E3s、26S蛋白酶體等組分間的級聯反應來降解蛋白的一種方式。本研究以斑節對蝦轉錄組數據庫中篩選獲得泛素融合蛋白L40（PmUbL40）基因片段，通過RACE方法克隆得到了PmUbL40的cDNA全長序列，預測氨基酸序列含有1個高度保守的泛素結構域和核糖體蛋白L40結構域，并含有1個C2-C2型鋅指結構和1個核定位序列。序列比對結果發現，各物種間UbL40氨基酸序列的相似性均達90%以上，表明各物種UbL40序列在進化過程中高度保守。通過對PmUbL40氨基酸序列的磷酸化位點的預測，該蛋白存在1個蘇氨酸磷酸化位點（T22）、2個絲氨酸磷酸化位點（S57和S108）、1個酪氨酸磷酸化位點（Y89），磷酸化位點作為信號傳導等調控分子的重要結構，可以預測PmUbL40在細胞增殖和細胞周期中起到廣泛的調控作用。PmUbL40蛋白由泛素結構域和核糖體蛋白L40結構域兩部分組成，核糖體蛋白L40結構域參與核糖體60S大亞基的組裝，形式分子伴侶的功能。在這過程中，由特殊的肽鏈內切酶識別泛素結構域和核糖體蛋白L40結構域之間的酶切位點，將核糖體蛋白L40結構域切下，釋放出泛素結構域進入UPP途徑形式功能。

PmUbL40基因在斑節對蝦各組織的表達定量結果中顯示，在肝胰腺中表達量顯著高于其他各組織，其次為肌肉和卵巢，研究表明甲殼動物的肝胰腺是營養物質消化和儲存的重要器官，與甲殼動物的生長發育和生殖具有密切關系［11］，結果暗示了PmUbL40可能對于斑節對蝦的蛋白分解與利用具有一定作用。

本研究對斑節對蝦卵巢發育不同時期中PmUbL40的表達結果顯示，卵巢發育Ⅱ期顯著高于其他各期，其次為Ⅴ期，顯著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期。斑節對蝦卵巢發育過程主要包括卵子的形成和卵黃積累的過程。細胞周期在細胞分裂和配子形成過程中具有重要作用［12-13］，而在細胞周期過程中，各個發育時期的過度需要細胞周期蛋白激活并在下一個發育時期降解以便于細胞周期的正常進行，細胞內80%以上蛋白質包括大多數的周期蛋白是通過UPP降解的［14］。卵巢發育Ⅰ期是卵原細胞期，主要以有絲分裂為主的卵原細胞的增殖，而此期PmUbL40基因表達相對較低，說明該基因可能較少參與前期的細胞有絲分裂過程。卵巢發育Ⅱ期開始卵原細胞的減數分裂以及卵黃合成的前期準備，而此期PmUbL40大量表達，說明PmUbL40可能參與卵巢發育減數分裂過程，以及可能對卵黃蛋白的形成起到調節作用。隨著卵巢發育的逐步成熟，卵巢發育即將開始一個新的周期，此時成熟期（即發育Ⅴ期）卵巢PmUbL40表達較為升高。

UPP途徑中對甲殼動物的性腺發育和配子發生具有重要作用，Zhang 等［15］在日本沼蝦中克隆了Ubc9基因，通過實時定量PCR檢測了Ubc9基因的表達情況，結果顯示Ubc9基因在卵巢發育早期表達較低，卵黃粒期時達到最大，而成熟期降至最低值，表明Ubc9基因可能在卵子發生過程中扮演著重要角色。戴燕彬等［16］篩選出泛素基因（Ubquitin）片段，其cDNA 序列全長555 bp， 并對其結構進行分析，利用實時定量 PCR 技術檢測發現，Ub 在鰓中的表達水平最高，卵巢次之，各組織間的表達無顯著性差異，Ub在卵巢發育O5 期的表達水平最高，O1、O4 期次之，O2 期表達量最低且與 O5 期具有顯著差異，Ub在精巢發育T2 期的表達量最高，其次為 T1 期，T3 期表達最低且與 T2期具有顯著差異，表明Ub對于擬穴青蟹生殖細胞的發育可能具有重要作用。Wang等［17］利用RTPCR檢測了中華絨螯蟹EsSUMO-1 和EsUbc9基因分別在精巢和卵巢中的表達情況，結果EsSUMO-1 和EsUbc9基因在精巢Ⅱ-1階段表達適中，在Ⅱ-2階段增多，然后逐漸下降；在卵巢中，早期EsSUMO-1 和EsUbc9基因表達低，在Ⅲ-2階段表達量達到最大，在Ⅳ期逐漸降低，表明在中華絨螯蟹精卵子發生過程中EsSUMO-1 和EsUbc9基因可能具有重要作用。Shen等［18］采用退火控制引物技術從日本囊對蝦性腺中篩選出泛素綴合酶E2r基因并證明其在精巢中的表達水平高于卵巢，在精巢T2期的表達水平達到最高，而在卵巢O1表達最低，在卵巢O4和O5的表達值相近。Leelatanawit等［19］在斑節對蝦精巢cDNA文庫中找到許多精巢發育相關基因，如SUMO-1、泛素綴合酶E2等。Preechaphol等［20］在斑節對蝦卵巢EST文庫中找到X染色體泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，X-linked，Usp9x），并對該基因在精卵巢不同發育時期中的表達進行研究，結果表明該基因在O5期表達水平達到最高值，而在精巢中T2期表達量最高，可能是精巢中大量生精細胞處于快速增殖期。本研究中，PmUbL40基因卵巢發育Ⅱ期的表達量最高，可能參與了卵巢組織中的卵母細胞的快速增殖。

綜上所述，本研究克隆了斑節對蝦PmUbL40基因的全長cDNA序列并對基因序列，研究了PmUbL40基因在不同組織和卵巢發育不同時期的表達特征，為研究PmUbL40在斑節對蝦卵巢發育和卵子發生可能具有重要作用奠定基礎。

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（責任編輯 崔建勛）

Molecular characterization and expression profiles of UbS27 gene from black tiger shrimp （Penaeus monodon）

FU Ming-jun1，2，WU Song1，3，TANG Lei1，4，ZHOU Fa-lin1，QIU Li-hua1，JIANG Shi-gui1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.Tropical Aquaculture Research and Development Center of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Sanya 572018，China 3.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；4.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Penaeus monodon ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein gene （PmUbL40） was identified and characterized by using an approach which combines the data of transcriptome and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The expression profile of PmUbL40 in different development stages of the ovary and various tissues were determined by real-time quantitative PCR.The full length cDNA of PmUbL40 gene was of 390bp，which encoded a protein of 129 amino acids with estimated molecular mass of 14.7 ku and theoretical isoelectric point of 9.76.The encoded protein consists ubiquitin domain （1-76aa）and ribosomal L40 domain （77-129aa）.Real-time quantitative PCR results showed that PmUbL40 was expressed high in hepatopancreas than in other tissues.And PmUbL40 was expressed the highest in the ovary stay II，and than in ovary stage V，which indicated that PmUbL40 may play an important role in ovary development and oogenesis.

Penaeus monodon；ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein （UbL40）；ovary development；gene cloning

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.027

2015-04-04

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-47）；廣東省科技計劃項目（2013B040402016，2014A020208039）；海南省自然科學基金（20163147）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（2014TS12）

傅明駿（1983-），男，博士，助理研究員，E-mail：fu.mj@163.com

江世貴（1964-），男，博士，研究員，E-mail：jiangsg@21cn.com

S917；Q786

A

1004-874X（2016）04-0144-07