黔產苦參ISSR-PCR反應體系正交優化研究

金 燕, 龍慶德， 常楚瑞， 陸平祝, 王曉麗

(貴州醫科大學,貴州貴陽 550004)

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黔產苦參ISSR-PCR反應體系正交優化研究

金 燕, 龍慶德， 常楚瑞*， 陸平祝, 王曉麗

(貴州醫科大學,貴州貴陽 550004)

摘要[目的]確定適合苦參穩定的ISSR-PCR反應體系。[方法]采用經典的CTAB法提取苦參新鮮幼嫩葉片DNA；針對Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶進行正交設計L16(45)，優化黔產苦參ISSR-PCR反應體系。[結果]最適ISSR-PCR反應體系為：模板DNA 90 ng、0.4 μmol/L 引物、2.0 mmol/L Mg2+、Taq DNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L dNTPs。[結論]建立的苦參ISSR-PCR反應體系，經過19 份苦參樣品檢驗，證明該體系穩定可靠，可用于苦參遺傳多樣性分析。

關鍵詞苦參；CTAB；ISSR-PCR 反應體系；正交設計

苦參(Suphora flavercensAit.)為豆科槐屬植物，是我國常用的傳統中藥，全國各地均有分布。臨床研究證實，苦參中含有多種化學成分，具有廣泛的藥理作用[1-2]，其臨床主要用來治療寄生蟲病、細菌性疾病、乳糜尿、哮喘、心率失常、慢性乙肝炎、腎小球腎炎、肝硬化腹水[3]、癌癥、失眠癥、躁狂癥、皮膚病、婦科炎癥(如痛經、白帶、尿道炎)等。

近年來，隨著分子生藥學的推廣，從分子水平上對中藥材進行相關研究受到關注，方法也得以完善，為準確、科學地評價苦參種質資源提供了有利工具[4]。簡單重復序列區間(ISSR)是1994年發展的一種基于微衛星系列的分子標記技術，用于檢測簡單重復序列(SSR)間DNA序列差異，具有不需要知道序列信息、簡便、快捷、重復性好等特點，比隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)具有更高的可重復性和穩定性，該技術已經廣泛應用于中藥材遺傳多樣性與親緣關系研究，并取得了較好的成效[5]。苦參的化學成分、提取工藝、藥理、臨床及農業應用等幾個方面國內外的研究比較多[1-3]，苦參的分子生物學方面的研究還處于起步階段。該試驗采用經典溴化十六烷基三甲銨法(CTAB)法提取苦參DNA，針對ISSR-PCR反應體系Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和TaqDNA聚合酶這5個主要因素進行正交設計，優化黔產苦參ISSR-PCR反應體系，為苦參遺傳多樣性的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。METTLERTOLEDO電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，HH-Z數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，TGL-16G臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，DYY-2C型電游儀(北京市六一儀器廠)，核酸蛋白分析儀(DU64O型)，BIO-RADChemiDocXRS+化學發光成像儀(美國BIO-RAD)，BIO-RADCFXConnectTM熒光定量PCR檢測儀(美國BIO-RAD)。

1.1.2試劑。β-巰基乙醇、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、液氮、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、EDTA-Na2(乙二胺四乙二鈉鹽)、CTAB(溴化十六烷基三甲胺)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、GoldView核酸染料、6×loadingbuffer、核糖核酸酶。

1.1.3試材。苦參由野外采收，經貴州醫科大學藥用植物學與生藥學教研室常楚瑞老師鑒定為苦參(SophoraflavercensAit.)，將采收回來的苦參種植以備后續試驗所需，以苦參新鮮幼嫩葉片為DNA提取的材料。

1.2方法

1.2.1經DNA的提取與檢測。根據文獻[6]的CTAB法略做改進，提取苦參DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小、降解情況及濃度。取 8μLDNA原液, 加 2μL6×loadingBuffer，混勻后點入瓊脂糖凝膠,100V恒壓電泳40min，凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.2核酸蛋白分析儀檢測。取1μLDNA原液，用微量分光光度計測定提取DNA的A260/280值。A260/280應在1.80～2.00，低于1.80說明蛋白質、多糖和苯酚未除盡，高于 2.00 說明可能還含有RNA。

1.2.3單因素試驗。PCR反應體系總體積為25μL，內含Mg2+濃度 2mmol/L、dNTPs濃度 0.4mmol/L、引物0.5μmol/L、模板DNA30ng、TaqDNA聚合酶 1U。PCR擴增程序為95 ℃ 預變性 5min、95 ℃ 變性 30s、58 ℃ 退火 30s、72 ℃ 延伸 60s，35 個循環，72 ℃ 延伸 5min[7]。擴增產物用 2.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，GoldView核酸染料染色，在1×TAE緩沖液中100V恒壓電泳 40min，凝膠成像儀上觀察并拍照。以預設反應體系為基礎，對模板DNA、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶和dNTPs這 5 個主要影響反應體系因素進行條件摸索，預設的各因素濃度水平如表1所示。

表1　苦參 ISSR-PCR 單因素試驗水平

1.2.4ISSR-PCR反應體系的正交優化。通過預試驗，以模板DNA、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶和dNTPs這 5 個主要影響反應體系因素[8-11]，最適引物UBC881(GGGTGGGGTGGGGTG)進行正交試驗，每個因素選擇 4 個水平，設計因素水平(表2)。

表2　ISSR-PCR 反應體系正交因素水平

表3　L16(45) 正交設計試驗

1.3數據分析依據擴增條帶的多少、清晰度、亮度和雜帶的有無對PCR擴增結果進行打分，最低分0分，最高分為16分。求出同因素不同水平間的極差值R,對各因素不同水平均值Ki值制作Excel表進行數據分析，確定各因素的最優用量和濃度水平。

2結果與分析

2.1DNA檢測由圖1可見，經典CTAB法提取的DNA條帶清晰，分子量大小一致，電泳條帶較亮，說明該方法提取DNA濃度較高，其 A260/280為1.8～2.0，DNA濃度為795～2 800μg/mL,說明CTAB法提取的DNA質量較高，可用于后續試驗。

圖1　CTAB法提取苦參DNA電泳圖Fig.1　DNA electrophoretogram of S.flavercens by CTAB method

2.2單因素試驗模板DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶和dNTPs在濃度范圍內擴增的條帶較多且清晰明亮。引物濃度在 0.1和 0.3μmol/L時較其他濃度條帶多，擴增效果好。依據單因素試驗結果，選擇擴增效果好的濃度范圍，重新劃分 4個濃度梯度(表2)，作為正交試驗各因素的水平。

2.3ISSR引物擴增檢測從圖2可看出，由于模板DNA、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶和dNTPs5 種影響因素組合的不同，擴增效果存在明顯差異。4 和 14 號沒有擴增條帶，8 和 10 號有微弱的擴增，1、2、3、7、9、11和13號有明顯的擴增，1、2、3、9、11和13號泳道有彌撒現象，9、11和13號擴增多態性較1、2、3和7號好，5、6、15、16號有明顯的擴增，條帶清晰可辨，但亮度較暗，因此綜合擴增條帶的數目、強弱清晰度和可分辨率等指標比較，12 號因素水平組合(模板DNA90ng、0.4μmol/L引物、2.0mmol/LMg2+、TaqDNA聚合酶 0.5U、0.5mmol/LdNTPs)擴增的效果最好，條帶相對較多且清晰。由表3可知，苦參ISSR-PCR體系中含因素影響從大到小依次為引物、dNTPs、Mg2+、模板DNA、TaqDNA聚合酶，可見，引物影響最大，而 TaqDNA聚合酶影響最小。最佳的ISSR-PCR反應體系為A3B3C2D1E2，即模板DNA90ng、0.3μmol/L引物、2.0mmol/LMg2+、TaqDNA聚合酶 0.5U、0.4mmol/LdNTPs，與電泳圖的直觀分析相比，只有引物和dNTPs濃度不一樣，所以正交試樣 12 號為最佳的ISSR-PCR反應條件。根據確定的ISSR-PCR反應體系對 19 份苦參樣品檢驗, 結果條帶多且清晰明亮，證明該體系穩定可靠,可用于苦參遺傳多樣性分析。

圖2　正交設計 ISSR-PCR 反應體系擴增結果Fig.2　Amplificated results of ISSR-PCR reaction system of orthogonal design

3討論與結論

苦參的化學成分主要有生物堿和黃酮類化合物，同時含有糖、酚和蛋白質等一些次生代謝物質，該試驗以苦參新鮮幼嫩葉片為試驗材料，用經典CTAB法對苦參進行DNA提取，結果提取的DNA質量較好，可以滿足后續試驗。

引物濃度會對PCR所擴增的帶型產生明顯的影響，濃度過低時PCR產率會大大降低，甚至不能擴增，濃度過高時PCR所擴增的條帶會變得模糊，還會產生新的位點，非特異性擴增增加；Mg2+作為ISSR-PCR反應中的一個主要因素，其濃度的變化對整個PCR反應中的TaqDNA聚合酶的活性、引物的退火溫度以及PCR擴增條帶的特異性均有一定的影響；DNA模板量也是影響ISSR-PCR擴增效果的主要因素之一，模板量過低，無擴增產物或產物少而不穩定，量過高，又會導致擴增條帶的模糊和非特異性產物的出現；酶的用量在PCR反應中也是一個重要的影響因素，濃度過低則不能擴增，濃度太高又會產生非特異性擴增且增加成本；dNTPs是PCR擴增反應中磷酸基團的主要原料，dNTPs的濃度對PCR反應有至關重要的影響，當dNTPs濃度較高(>200μmol/L)時，可加快PCR的反應速度，但同時也會增加堿基的錯誤摻入率與試驗成本，當dNTPs濃度較低(<50μmol/L)時，則會導致PCR的產率下降，因此，dNTPs的濃度常控制在50～200μmol/L為最佳[11]。該研究通過ISSR-PCR反應體系的建立與優化，確定最適黔產苦參ISSR-PCR的反應體系為模板DNA90ng、0.4μmol/L引物、2.0mmol/LMg2+、TaqDNA聚合酶 0.5U、0.5mmol/LNTPs。苦參ISSR-PCR反應體系的建立填補了國內苦參ISSR分子標記的空白，為利用分子標記技術研究苦參種質資源鑒定和遺傳多樣性等提供理論依據。

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基金項目貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項(黔科合ZY字[2012]3004號)；貴州省科技計劃項目(黔科合重大專項字[2015]6009-2)。

作者簡介金燕(1987- )，女，貴州六盤水人，初級藥師，碩士，從事生藥學研究。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事分子生藥學、中草藥質量標準及研發工作。

收稿日期2016-04-20

中圖分類號S 567.5+3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-114-03

OrthogonalOptimizationofISSR-PCRReactionSystemofSuphora flavercensAit.

JINYan,LONGQing-de,CHANGChu-rui*etal

(GuizhouMedicalUniversity，Guiyang，Guizhou550004)

Abstract[Objective]To select a suitable method of ISSR-PCR reaction system for Suphora flavercens Ait.[Method] Modified CTAB method was used to extract the genomic DNA from fresh young leaves of S.flavercens.The suitable ISSR-PCR reaction system was established by orthogonal design L16(45) based on the Mg2+, dNTPs, primer,template DNA and Taq DNA.[Result]The optimal conditions in 25 μL ISSR-PCR system were 90 ng DNA template, 0.4 μmol/L primer, 2.0 mmol/L Mg2+, 0.5 U TaqDNA Polymerase, and 0.5 mmol/L dNTPs.[Conclusion]The established ISSR-PCR reaction system is verified by 19 samples of S.flavercens, which verifies that this system is stable and reliable, and can be used for the analysis of genetic diversity of S.flavercens.

Key wordsSuphora flavercens Ait; CTAB; ISSR-PCR reaction system; Orthogonal test