尾巨桉3個無性系繼代增殖培養研究

石 前， 李飛宇， 梁秀莉， 鄧冬麗， 李麗芳， 蘭 俊*

(1. 廣西壯族自治區國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京100028)

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尾巨桉3個無性系繼代增殖培養研究

石 前1， 李飛宇2， 梁秀莉1， 鄧冬麗1， 李麗芳1， 蘭 俊1*

(1. 廣西壯族自治區國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3個無性系繼代增殖培養技術，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據。[方法]以尾巨桉3個無性系DH32-26、DH32-29、DH32-28為試驗材料，篩選最佳的植物生長調節劑組合、凝固劑、暗培養天數和培養瓶，達到較高的繼代增殖系數。[結果] 3個無性系繼代增殖培養時最適的植物生長調節劑組合為：DH32-26(6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-28(6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L)；DH32-29(6-BA 0.3 mg/L+NAA0.2 mg/L)；DH32-26的繼代增殖系數在凝固劑為卡拉膠和瓊脂的培養基中差異不大，DH32-28、DH32-29的繼代增殖系數在以卡拉膠作為凝固劑的培養基中比在以瓊脂作為凝固劑的培養基中有所提高，在生根培養過程中，以卡拉膠作為凝固劑的培養基遠比用瓊脂作為凝固劑的培養基誘導出根好；繼代增殖初期DH32-26、DH32-28需用黑布進行全暗遮光5～10 d，而DH32-29不需全暗培養；用廣口瓶繼代增殖培養DH32-29可降低苗木生產成本，但DH32-26、DH32-28不適合用廣口瓶進行繼代增殖培養。[結論]要提高無性系繼代增殖系數，需要選取最優的植物生長調節劑組合、凝固劑、暗培養天數和培養瓶。

關鍵詞尾巨桉；無性系；繼代增殖

目前在造林中推廣應用較多的無性系是尾巨桉系列的優良無性系，已應用于造林的尾巨桉優良無性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。其中DH32-26在速豐林高產競賽評比活動中，年均蓄積生長量優于其他品種，被評為最優品種。根據造林試驗效果反饋，DH32-29和DH32-28也獲得了較好的評價。從選育到推廣造林，尾巨桉無性系在廣西和華南地區的桉樹造林中占據重要地位，為林漿紙板一體化的發展做出巨大貢獻，產生了巨大的經濟效益和社會效益。

在生產中，單一無性系造林易受病蟲的襲擊，給造林戶造成直接經濟損失，采用多種無性系造林對林分的穩定性有一定的促進作用。目前在尾巨桉組培快繁技術方面已有一定的研究，但對尾巨桉不同無性系在組織培養方面的差異性研究還較少。由于各無性系的遺傳物質不同，所以在外植體誘導、繼代增殖培養、生根培養、移栽方面有不同的要求。筆者以尾巨桉3個優良無性系(DH32-26、DH32-29、DH32-28)為研究對象，從繼代增殖培養方面探索桉樹不同無性系在組培技術上的差異性，以期完善尾巨桉的快繁技術，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況試驗地位于崇左市扶綏縣廣西國營東門林場林業科學研究所國家良種繁育中心苗圃，107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，東西長80km、南北寬20km，屬于南亞熱帶地區，季風氣候明顯，年日照時數1 634～1 719h，年平均氣溫22 ℃，極端最高氣溫40 ℃，極端最低氣溫-4 ℃，位于十萬大山的雨影區，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300mm，相對濕度74%～83%。

1.2供試材料尾巨桉3個無性系DH32-26、DH32-29、DH32-28。

1.3研究方法

1.3.1植物生長調節劑組合對無性系繼代苗增殖的影響。以改良MS為繼代培養的基本培養基，添加6-BA、NAA形成6 種濃度組合的增殖培養基(表1)。各處理3個重復，每重復5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽。將誘導出的無菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽接種到增殖培養基上培養，20d后觀察各培養基叢生芽分化情況，統計繼代苗平均苗高、增殖系數、生長狀況及有效芽苗數，篩選出適宜的植物生長調節劑組合。

表1不同植物生長調節劑組合

Table1Combinationofgrowthregulatorsofdifferentplants

mg/L

1.3.2凝固劑對無性系繼代苗增殖的影響。研究瓊脂和卡拉膠2種凝固劑對不同無性系繼代苗增殖的影響，瓊脂用量為4g/L(1 300g/cm2強度)，卡拉膠用量6g/L。將誘導出的無菌材料DH32-26、DH32-28、DH32-29不定芽分別接種到用瓊脂和卡拉膠作為凝固劑的改良MS繼代培養基中，各處理3個重復，每重復5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，接種 20d后統計繼代苗平均高、增殖系數、生長狀況。

1.3.3暗培養天數對無性系繼代苗增殖的影響。繼代苗接種后，不能直接放在強光下培養，一般要暗培養一段時間。研究不同暗培養天數對不同無性系繼代苗增殖的影響，試驗設4個處理：黑布覆蓋0 (弱光培養5d)、5、10、15d。各處理3個重復，每重復5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，25d后統計繼代苗平均高、繼代增殖系數、繼代苗生長狀況。

1.3.4培養瓶對無性系繼代苗增殖的影響。采用2種培養瓶，即500mL的三角瓶和250mL的廣口瓶進行繼代培養，研究這2種培養瓶對尾巨桉3種無性系繼代苗增殖的影響。各處理3個重復，每重復5瓶，每瓶接入15叢芽，每叢2～3條芽，20d統計繼代增殖系數、平均有效芽數、繼代苗生長狀況。

2結果與分析

2.1植物生長調節劑組合對無性系繼代苗增殖的影響植物生長調節劑是一種活性物質，對植物生長發育有調節作用。用于繼代增殖培養的是能促進芽分化的細胞分裂素和促生長的生長素，具體運用時要根據需要來決定兩者的比例。DH32-26在6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養基中葉淡綠，有效芽最多；DH32-28在6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L培養基中葉色綠，芽密，有效芽最多；DH32-29在6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L培養基中葉色綠而舒展，芽多而密，有效芽最多(表2)。

表2　植物生長調節劑組合對無性系繼代苗增殖的影響

2.2凝固劑對無性系繼代苗增殖的影響瓊脂和卡拉膠同為培養材料的支撐物，由于原料不同，其對繼代苗的增殖率有一定影響。研究3個無性系在瓊脂和卡拉膠凝固劑中的繼代增殖表現，結果表明在卡拉膠培養基中，DH32-26、DH32-28、DH32-29這3個無性系繼代苗高稍高于瓊脂培養基中苗高。DH32-29、DH32-28這2個無性系在卡拉膠培養基中繼代增殖系數比瓊脂的高，而DH32-26在卡拉膠培養基中繼代增殖系數與在瓊脂培養基中差別不大。各無性系在同一種凝固劑中，表現也有所不同，DH32-29繼代增殖系數最高，其次為DH32-28、DH32-26(表3)。

表3　凝固劑對無性系繼代苗增殖的影響

2.3暗培養天數對無性系繼代苗增殖的影響光照在植物組織培養中是一個十分重要的因子，在繼代苗增殖初期中，要形成大量的愈傷組織，需進行暗培養處理，一般在300～500lx的光照強度下，即放置在一般的暗培養架上弱光培養便可達到很好的增殖效果，但由于各無性系生理特點不同，這種方式達不到所需的增殖倍數，所以采用黑布覆蓋的避光措施，以達到提高繼代增殖率的目的。在繼代培養的后期，植物對光的需求加大，避光暗培養時間過長會影響繼代芽苗的質量。由表4可知，DH32-26和DH32-28全暗培養時間以10d內為宜，全暗培養時間過少苗不高，增殖系數低，過高苗水腫、纖細，DH32-29不用全暗培養也可達到好的效果。3個無性系隨著暗培養時間的增加，增殖系數和苗高也增加，但當全暗培養時間超過一定天數后，會出現莖纖細、弱，木質化差，苗水腫的現象。

表4　暗培養天數對無性系繼代苗增殖的影響

2.4培養瓶對無性系繼代苗增殖的影響由表5可知，由于三角瓶的底徑大，光線充足，采光更好，接種于三角瓶的繼代苗比接種于廣口瓶的繼代苗增殖系數高。由于空間不足，接種于廣口瓶的繼代苗有效芽較少。廣口瓶接受光照的面積少，對DH32-26、DH32-28這2個無性系來說其繼代苗需要較強光照，用廣口瓶作為繼代培養瓶，分化增殖不理想，用作生根有效芽少，而三角瓶比較適合它們所需的光照，用作生根有效芽多；對DH32-29來說廣口瓶作繼代培養瓶的光照已經滿足了它的生長，不論是用三角瓶作為繼代培養瓶，還是用廣口瓶作繼代培養瓶都可以。

表5　培養瓶對無性系繼代苗增殖的影響

3結論與建議

(1) 該試驗通過用6-BA和NAA的不同配比來篩選適合3個無性系繼代增殖的植物生長調節劑配方。根據試驗結果可得出，DH32-26繼代增殖培養適用的植物生長調節劑組合為6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-28繼代增殖培養適用的植物生長調節劑組合為6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L；DH32-29繼代增殖培養適用的植物生長調節劑組合為6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L。繼代培養的目的就是將誘導產生的芽不斷擴繁，使繁殖材料增多來達到繼代增殖的效果。繼代培養基中，對芽器官分化起重要作用的是細胞分裂素，細胞分裂素要與生長素配合使用，在合適的配比下才能達到較好的效果[1-2]，過高或者過低都不利于繼代增殖[3]。在專做繼代增殖時，6-BA與NAA比值增大可提高繼代增殖系數，但如果比值過大，繼代苗過于細弱，玻璃化苗的幾率增大。

(2) 為找出適合DH32-26、DH32-28、DH32-29無性系的暗培養方式，該試驗做了4個暗培養時間處理，試驗結果表明DH32-26、DH32-28這2個無性系需用黑布覆蓋全暗培養5～10d，苗高和繼代增殖系數會有所提高，有效芽增多，DH32-29只需弱光培養就可達到較高的繼代增殖系數。桉樹繼代培養中，光照是一個較重要的環境因子，桉樹無性系不同，對環境條件的要求也不同，繼代增殖初期需要避光培養，長時間在光線不足的環境中，植物會出現玻璃化和徒長現象[4-6]。

(3)在桉樹繼代培養中使用的是固體培養基，瓊脂和卡拉膠屬于凝固劑，用于提取它們的海藻種類不同，表現特性也不同。用瓊脂配制培養基，其凝固性和穩定性好，但價格較貴，用卡拉膠配制的培養基，非常透明，易于觀察瓶內的培養材料。該試驗用含有這2種凝固劑的培養基接入3種無性系的繁殖材料，進一步觀察3種無性系在2種凝固劑培養基中繼代增殖系數及苗木表現，試驗結果表明DH32-28、DH32-29這2個無性系的繼代增殖系數在含卡拉膠凝固劑

的培養基中稍有提高，但在此培養基中繼代苗易老、黃化，當放置在溫度較高(超過30℃以上)的高架煉苗時，培養基會溶解成水，繼代苗沒有了培養基的支撐，逐漸枯萎。卡拉膠會化為水，變成水培狀，但瓊脂未出現此情況，這現象說明卡拉膠的穩定性不如瓊脂。

(4)工廠化育苗是進行大規模、高效率的組培苗生產，不僅對數量和質量有要求，而且要考慮如何降低生產成本，提高生產和經濟效益。組培生產中用量最多的是培養瓶，如果能在此項尋找到合適的替代品，可以降低成本。目前使用繼代培養的大多是三角瓶，在廣東的很多組培廠使用的是廣口瓶(罐頭瓶)。三角瓶的價格高，1個500mL的三角瓶約6元，而廣口瓶價格低，1個廣口瓶0.7元，價格相差8倍左右。在節約成本的同時，也要考慮苗木的質量，為探求這2種繼代培養瓶對3種無性系繼代苗生長和增殖的影響，經過試驗，結果表明DH32-29在2種繼代培養瓶中，繼代增殖系數沒有大的變化，以三角瓶為培養瓶的消毒用時多，工序繁瑣，而用廣口瓶為培養瓶方便操作，速度快，DH32-29對光照要求不是很嚴格，可用2種培養瓶進行繼代培養，但從成本上來說用廣口瓶作繼代培養瓶比較劃算；DH32-26、DH32-28用廣口瓶作繼代培養瓶時，繼代增殖有效芽少，光線太弱，而這2個無性系對光照的需求較強，用三角瓶作為繼代培養瓶能滿足它們對光照的需求，因此對DH32-26和DH32-28這2個無性系來說，用三角瓶作為繼代培養瓶較為合適。

參考文獻

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作者簡介石前(1982-)，女，湖南衡陽人，工程師，碩士，從事林木良種繁育研究。*通訊作者，高級工程師，碩士，從事桉樹遺傳改良和無性系開發研究。

收稿日期2016-05-16

中圖分類號S 722.8

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-179-04

MultiplicationSubcultureofThreeClonesofEucalyptus urophylla × E. grandis

SHIQian1,LIFei-yu2,LIANGXiu-li1,LANJun1*etal

(1.GuangxiDongmenForestFarm,Fusui,Guangxi532108; 2.ChinaSeedInternationalSeedCo.,Ltd.,Beijing100028)

Abstract[Objective] To research the multiplication subculture technology of three clones of Eucalyptus urophylla × E. grandis, and to provide theoretical foundation for the rapid propagation of E. urophylla × E. grandis seedlings. [Method] With three clones (DH32-26, DH32-29, DH32-28) as the test materials, the optimal combination of regulators was screened, as well as the coagulator, dark culture days and culture flask. Thus, multiplication coefficient was relatively high. [Result] The optimal combination of plant growth regulators for subculture of three clones were DH32-26(6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L), DH32-28(6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L) and DH32-29(6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.2 mg/L). DH32-26 multiplication coefficient showed no significant differences in culture medium with carrageenan and agar as the coagulators. Subculture multiplication coefficients of DH32-28 and DH32-29 in culture medium with carrageenan as the coagulator was higher than those with agar as the coagulator. During the process of rooting, culture medium with carrageenan as the coagulator had far better rooting than that with agar as the coagulator. In the initial stage of DH32-26 and DH32-28 subculture, black cloth was used for shading for 5-10 d; while DH32-29 did not need all dark culture. DH32-29 subculture in wild-mouth bottle reduced the production cost of seedlings; but DH32-26 and DH32-28 were not suitable for the subculture in wild-mouth bottle. [Conclusion] To enhance the multiplication coefficient of clones, we should select the optimal regulators, coagulator, dark culture days and culture flask.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clones; Multiplication